[发明专利]一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15

说明书

技术领域

本发明涉及黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15。

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1的毒性最强，它的毒性是氰化钾的10倍，砒霜的68倍。早在1993年，黄曲霉毒素B1被世界卫生组织的癌症研究机构划定为已知最强致癌化学物质之一，即Ⅰ类致癌物质。我国属于黄曲霉毒素污染较重的地区，在各种食物及农产品，尤其是玉米、花生及其制品中都很有可能存在黄曲霉毒素的污染。因此加强黄曲霉毒素的检测、特别是速测，及时了解和掌握各种食物及农产品的卫生信息，对保障我国食品消费安全具有重要意义。

现有黄曲霉毒素的检测方法包括化学分析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中化学分析法是早期检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。免疫分析是利用抗原和抗体的特异性的结合反应和抗体、抗原上的标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素的抗体。

随着抗体技术的发展，重组抗体在黄曲霉毒素的检测领域也逐渐被应用。与传统的多克隆抗体、单克隆抗体相比较而言，重组抗体具有其独特的优势，可以在原核表达体系里在很短的时间内大量生产并且生产费用低廉，对黄曲霉毒素的低成本、大规模检测有重要的应用价值，可以满足日益增长的黄曲霉毒素抗体的生产需要。纳米抗体是采用分子生物学手段，获得骆驼科动物体内的天然重链抗体可变区片段，并能与抗原特异性结合。目前，尚没有针对黄曲霉毒素B1的纳米抗体的相关报道。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15。

为实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：

黄曲霉毒素纳米抗体基因库，其特征在于：提取经黄曲霉毒素B1抗原免疫后的羊驼血液中的RNA，并采用RT-PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化得到。

上述方案中，所述pCANTAB 5E（his）载体是通过如下方法构建得到：以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物：p5E SfiI-F: 5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’(Sfi I)；下游引物：p5E N-P-H-R: 5’- GATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCG GCCGCCCGTTTTC-3’ PCR扩增pCANTAB5E载体质粒上Sfi I 到NotI之间的DNA片段，得到p5E-his片段；然后将p5E-his片段先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得p5E（SfiI/NotI）粘性末端；最后将p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端和p5E（SfiI/NotI）粘性末端连接后，得到pCANTAB 5E（his）载体。

黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，具体操作方法如下：对羊驼免疫黄曲霉毒素B1抗原，提取经免疫后羊驼血液中的RNA，反转录为cDNA，设计特异性引物，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后将VHH基因与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化，构得黄曲霉毒素纳米抗体基因库。