[发明专利]一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素B1纳米抗体2014AFB-G15

权利要求书

1.黄曲霉毒素纳米抗体基因库，其特征在于：提取经黄曲霉毒素B1抗原免疫后的羊驼血液中的RNA，并采用RT-PCR的方法特异性扩增羊驼重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化得到；所述pCANTAB 5E（his）载体是通过如下方法构建得到：以pCANTAB5E载体质粒为模板，通过上游引物：p5E SfiI-F:5’-ATGCGGCCCAGCCGGCC-3’(SfiI)；下游引物：p5E N-P-H-R: 5’- ATCGGGCCCTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCGGCCGCCCGTT TTC-3’PCR扩增pCANTAB5E载体质粒上Sfi I 到NotI之间的DNA片段，得到p5E-his片段；然后将p5E-his片段，先做SfiI单酶切再做PspoMI单酶切，得p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端，将pCANTAB5E载体质粒先做SfiI单酶切再做Not I单酶切，得p5E（SfiI/NotI）粘性末端；最后将p5E-his(SfiI/PspoMI) 粘性末端和p5E（SfiI/NotI）粘性末端连接后，得到pCANTAB 5E（his）载体。

2.权利要求1所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于，具体操作步骤为：对羊驼免疫黄曲霉毒素B1抗原，提取经免疫后羊驼血液中的RNA，反转录为cDNA，设计特异性引物，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到羊驼血液中重链抗体IgG2和IgG3的可变区基因，即VHH基因，然后将VHH基因与pCANTAB 5E（his）载体连接后转化，构得黄曲霉毒素纳米抗体基因库。

3.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于：所述特异性引物的末端包含根据pCANTAB 5E（his）载体克隆位点附近序列设计的在VHH基因两端分别引入载体pCANTAB 5E（his）同源序列的引物序列，每条特异性引物的末端至少包含15bp的载体pCANTAB 5E（his）同源位点，以在VHH基因两端各引入至少15bp的载体pCANTAB 5E（his）同源序列，所述特异性引物为：

R1:  5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCATGGGGGTCTTCGCTGTGGTG CG -3’

F:   5-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’；或

R2:  5’-CGGCGCACCTGCGGCCGCGTCTTGTGGTTTTGGTGTCTTG GG -3’；

F:   5-TCCTTTCTATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCC CAGKTGCAGCTCGTGGAGTC-3’，其中横线部分表示的引物序列为与载体pCANTAB 5E（his）同源的位点。

4.根据权利要求2所述的黄曲霉毒素纳米抗体基因库的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：

10× Ex taq Buffer               5μl

50mM MgSO₄                                              2μl

10 mM dNTP                           1μl     

10 mM F引物                          1μl

10 mM R1引物或R2引物           1μl

Ex taq DNA 聚合酶                 0.1μl

cDNA 模板                             2μl

ddH2O  补至总体系               50μl；

PCR扩增程序为：94℃ 2min；94℃ 30s，55℃ 30s，68℃ 1min，扩增30个循环；68℃ 5min；其中，以R1为引物的PCR扩增反应次数：以R2为引物的PCR扩增反应次数为2:3。