[发明专利]绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法

摘要

本发明属于分子植物病理学领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法。本发明确定了形成原生质体的合适条件，选择以1mol/L的甘露醇为稳渗剂，以7.5mg/mL的崩溃酶为裂解酶，制备高质量的原生质体，并将GFP转入到椰子茎泻血病菌，获得稳定遗传的GFP病原菌菌株，为该病菌的GFP转化、基因表达等遗传操作夯实基础，且节约成本，并能大大提高工作效率，缩短研究时间。同时，绿色荧光蛋白标记后的椰子茎泻血病菌便于该病害进行组织病理学和病害流行学等方面的研究。

主权项

一种绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将椰子茎泻血病菌菌块接种到CM培养基上26℃培养24h,然后研磨菌丝接种到液体酵母淀粉培养基震荡培养，转速120rpm,26℃培养36h，用灭菌的微细绒布过滤菌丝，然后用无菌水冲洗菌丝，再用1mol/L的甘露醇充分洗涤，用灭菌滤纸吸干水分；步骤二：用已灭菌三角瓶盛装已过滤除菌的7.5mg/mL崩溃酶液10mL和1.0g步骤一中洗涤并吸干的菌丝，用枪头轻轻吸打吹散均匀，将该三角瓶放入31℃恒温培养箱震荡培养1小时 ‑4h，转速90rpm，结束后，用三层灭菌的微细绒布过滤菌液于离心管中，转速4000rpm、4℃、离心10min，弃上清，用20mLSTC轻轻吸打混匀，进行二次离心，弃上清，以1mL‑3mLSTC溶解即可得到6.15×10⁸‑3.05×10⁹个/mL的原生质体悬液，再加入10%的DMSO,分装，150μL /管，置于‑80℃冰箱保存；其中所述崩溃酶液以1mol/L的甘露醇配制；步骤三：取2μg 绿色荧光蛋白pCT74‑sGFP质粒，转入步骤二150μL原生质离心管中,轻轻弹匀，静止30min,加600μL PTC混匀，静止20min,加入6mL TB3溶液，于26℃、90rpm复苏12h，然后将复苏液倒入100mL、45～55℃含40‑100μg/ml潮霉素B的TB3固体培养基中混匀，26℃倒置培养3‑4天，连续转接3代到含40‑100μg/ml 潮霉素B的PDA培养基上筛选性状稳定的转化子，再连续培养4代在无潮霉素B的PDA培养基上以确保其遗传稳定性，即获得了具有绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌菌株；以上试剂及培养基配制如下：（1）液体酵母淀粉培养基：酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蔗糖3g/L；（2）STC：1.2M山梨醇,50mM Tris‑Cl、pH8.0,50mM CaCL₂；（3）PTC：40%聚乙二醇3350，1.2M山梨醇,50mM Tris‑Cl、pH8.0,50mM CaCL₂；（4）TB3溶液即TB3培养基：蔗糖200 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，酵母提取物6 g/L；TB3固体培养基：含1.5%琼脂粉的TB3培养基。