[发明专利]绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法

权利要求书

1.一种绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：将椰子茎泻血病菌菌块接种到CM培养基上26℃培养24h,然后研磨菌丝接种到液体酵母淀粉培养基震荡培养，转速120rpm,26℃培养36h，用灭菌的微细绒布过滤菌丝，然后用无菌水冲洗菌丝，再用1mol/L的甘露醇充分洗涤，用灭菌滤纸吸干水分；

步骤二：用已灭菌三角瓶盛装已过滤除菌的7.5mg/mL崩溃酶液10mL和1.0g步骤一中洗涤并吸干的菌丝，用枪头轻轻吸打吹散均匀，将该三角瓶放入31℃恒温培养箱震荡培养1小时 -4h，转速90rpm，结束后，用三层灭菌的微细绒布过滤菌液于离心管中，转速4000rpm、4℃、离心10min，弃上清，用20mLSTC轻轻吸打混匀，进行二次离心，弃上清，以1mL-3mLSTC溶解即可得到6.15×10⁸-3.05×10⁹个/mL的原生质体悬液，再加入10%的DMSO,分装，150μL /管，置于-80℃冰箱保存；其中所述崩溃酶液以1mol/L的甘露醇配制；

步骤三：取2μg 绿色荧光蛋白pCT74-sGFP质粒，转入步骤二150μL原生质离心管中,轻轻弹匀，静止30min,加600μL PTC混匀，静止20min,加入6mL TB3溶液，于26℃、90rpm复苏12h，然后将复苏液倒入100mL、45～55℃含40-100μg/ml潮霉素B的TB3固体培养基中混匀，26℃倒置培养3-4天，连续转接3代到含40-100μg/ml 潮霉素B的PDA培养基上筛选性状稳定的转化子，再连续培养4代在无潮霉素B的PDA培养基上以确保其遗传稳定性，即获得了具有绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌菌株；

以上试剂及培养基配制如下：（1）液体酵母淀粉培养基：酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蔗糖3g/L；（2）STC：1.2M山梨醇,50mM Tris-Cl、pH8.0,50mM CaCL₂；（3）PTC：40%聚乙二醇3350，1.2M山梨醇,50mM Tris-Cl、pH8.0,50mM CaCL₂；（4）TB3溶液即TB3培养基：蔗糖200 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，酵母提取物6 g/L；TB3固体培养基：含1.5%琼脂粉的TB3培养基。