[发明专利]绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子植物病理学领域，具体涉及一种绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法。   

背景技术   

椰子茎泻血病（coconut stem bleeding disease）在我国尤其在海南发生越来越严重，在琼海，万宁，屯昌一带发病率有逐年上升的趋势。该病主要危害椰子茎基部，在病灶部位有铁锈状液体流出，严重影响观赏价值，最终导致植物死亡；也危害果实，使果实变黑脱落，使得椰果产量严重降低，给海南人民带来了很大的经济损失。其病原是奇异长喙壳菌（Ceratocystis paradoxa）的无性世代奇异根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa ）。

绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein,简称GFP）是1962年在美国西海岸所盛产的水母中发现的一种蛋白质，它不仅无毒，而且不必借助其他辅酶就能自身发光，标记了GFP，就可以在分子水平上研究活细胞的动态过程。

将GFP转入到椰子茎泻血病菌，获得稳定遗传的GFP病原菌菌株，为进一步研究该病原菌的侵染方式、扩展过程、传播途径等提供了保障，为该病害的防治奠定了基础。

原生质体的制备是进行遗传转化的前提和关键，对病菌进行遗传转化，构建病菌的突变体，是探讨致病机制，克隆致病基因，寻找控制该病害的有效途径。原生质体转化法与根癌农杆菌介导转化（REMI）、电击转化、限制性内切酶转化（ATMT）、基因枪法相比，不受限于昂贵的仪器设备，只需简单常规的仪器，操作简便易行。由于不同种、属真菌细胞壁的组分差异，因此酶解细胞壁的酶、所用酶量、菌丝的培养时间、所需稳渗剂等不尽相同，制备高质量的原生质体可以提高转化效率与实验成功率的保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌原生质体的制备方法，为该病菌的GFP转化、基因表达等遗传操作夯实基础，且节约成本，并能大大提高工作效率，缩短研究时间。

本发明采取的技术方案包括以下步骤：

步骤一：将椰子茎泻血病菌菌块接种到CM培养基上26℃培养24h,然后研磨菌丝接种到液体酵母淀粉培养基震荡培养，转速120rpm,26℃培养36h，用灭菌的微细绒布过滤菌丝，然后用无菌水冲洗菌丝，再用1mol/L的甘露醇充分洗涤，用灭菌滤纸吸干水分；

步骤二：用已灭菌三角瓶盛装已过滤除菌的7.5mg/mL崩溃酶液10mL和1.0g步骤一中洗涤并吸干的菌丝，用枪头轻轻吸打吹散均匀，将该三角瓶放入31℃恒温培养箱震荡培养1小时 -4h，转速90rpm，结束后，用三层灭菌的微细绒布过滤菌液于离心管中，转速4000rpm、4℃、离心10min，弃上清，用20mLSTC轻轻吸打混匀，进行二次离心，弃上清，以1mL-3mLSTC溶解即可得到6.15×10⁸-3.05×10⁹个/mL的原生质体悬液，再加入10%的DMSO,分装，150μL /管，置于-80℃冰箱保存；其中所述崩溃酶液以1mol/L的甘露醇配制；

步骤三：取2μg 绿色荧光蛋白pCT74-sGFP质粒，转入步骤二150μL原生质离心管中,轻轻弹匀，静止30min,加600μL PTC混匀，静止20min,加入6mL TB3溶液，于26℃、90rpm复苏12h，然后将复苏液倒入100mL、45～55℃含40-100μg/ml潮霉素B的TB3固体培养基中混匀，26℃倒置培养3-4天，连续转接3代到含40-100μg/ml 潮霉素B的PDA培养基上筛选性状稳定的转化子，再连续培养4代在无潮霉素B的PDA培养基上以确保其遗传稳定性，即获得了具有绿色荧光蛋白标记的椰子茎泻血病菌菌株；

以上试剂及培养基配制如下：（1）液体酵母淀粉培养基：酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蔗糖3g/L；（2）STC：1.2M山梨醇,50mM Tris-Cl、pH8.0,50mM CaCL₂；（3）PTC：40%聚乙二醇3350，1.2M山梨醇,50mM Tris-Cl、pH8.0,50mM CaCL₂；（4）TB3溶液即TB3培养基：蔗糖200 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，酵母提取物6 g/L；TB3固体培养基：含1.5%琼脂粉的TB3培养基。