[发明专利]一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系

摘要

本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系，属于基因工程技术领域。本发明通过同源重组技术，将G.oxydans中upp基因进行敲除，得到一upp基因缺陷型菌株；同时构建了含有一个能在G.oxydans中良好转录表达并具有条件致死功能的upp基因、一个用于G.oxydans转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因及一个MCS多克隆位点的重组整合质粒。该质粒适用于G.oxydans染色体基因敲除和替代，相比使用抗性标记基因作为筛选标记进行基因敲除有以下两点优势：不将抗性基因引入G.oxydans基因组中，避免了抗性基因对上下游基因产生极性作用；利用该敲除体系可以在同一菌株中进行多次染色体基因敲除和替代。

主权项

一种氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)无抗性标记基因敲除组合物，其特征在于包括一株upp基因缺陷型G.oxydans和一个携带了upp基因、抗生素抗性标记和多克隆位点的重组整合质粒；所述upp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重组整合质粒是将upp基因通过SacⅡ、ClaⅠ双酶切后连接到pK19mobsacB上，得到重组整合质粒pK19mobupp；所述upp基因缺陷型G.oxydans是将upp基因上下游各500bp核苷酸片段同源臂通过融合PCR连接，得到upp基因敲除框架，转化G.oxydans WSH‑003后得到的upp缺陷型菌株；所述upp基因上游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。