[发明专利]一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系

权利要求书

1.一种氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）无抗性标记基因敲除体系，其特征在于包括一株upp基因缺陷型G.oxydans和一个携带了upp基因、抗生素抗性标记和多克隆位点的重组整合质粒。

2.根据权利要求1所述的敲除体系，其特征在于，所述upp基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的敲除体系，其特征在于，所述upp基因缺陷型G.oxydans是将upp基因上下游各500bp片段同源臂通过融合PCR连接，得到upp基因敲除框架，转化G.oxydans后得到的upp缺陷型菌株。

4.根据权利要求3所述的敲除体系，其特征在于，所述upp基因上游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求1所述的敲除体系，其特征在于，所述重组整合质粒的抗生素抗性标记是卡那霉抗性标记。

6.根据权利要求1所述的敲除体系，其特征在于，所述重组整合质粒是将upp基因通过SacⅡ、ClaⅠ双酶切后连接到pK19mobsacB上，得到重组整合质粒pK19mobupp。

7.根据权利要求6所述的敲除体系，其特征在于，所述重组整合质粒pK19mobupp含有一个能在G.oxydans中转录表达并具有条件致死功能的upp基因、一个用于G.oxydans转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因，还含有一个MCS多克隆位点。

8.一种应用权利要求1所述敲除体系对G.oxydans进行基因敲除的方法，其特征在于，是将所需敲除的基因的敲除框架引入重组整合质粒的多克隆位点，得到重组整合载体，再将得到的重组整合载体转化upp缺陷型G.oxydans后，先后经抗生素抗性和抗5-氟尿嘧啶筛选得到目的基因缺陷型菌株。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将upp基因通过SacⅡ、ClaⅠ双酶切后连接到pK19mobsacB上，得到重组整合质粒pK19mobupp，再将所需敲除的基因的敲除框架引入重组整合质粒的多克隆位点，然后电转化upp基因缺陷型G.oxydans，进行筛选：第一轮筛选是筛选具有卡那霉素抗性的转化子，第二轮筛选是筛选抗5-氟尿嘧啶及对卡那霉素敏感的转化子。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述第一轮筛选，是将转化子涂布含卡那霉素的山梨醇平板；所述第二轮筛选是将在含卡那霉素的山梨醇平板上长出的转化子转接到含5-氟尿嘧啶和胸腺嘧啶的山梨醇平板。