[发明专利]一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌无抗性标记基因敲除体系，尤其是一种使用upp基因作为筛选基因在G.oxydans中进行基因敲除的体系及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）是一种专性好氧的革兰氏阴性菌属于醋酸杆菌科，对人和其它动物无病原性，但可引起水果的细菌性腐烂和褐变。该菌种含有多种酶类能不完全氧化有机物，产生多种重要化合物，这使得在工业应用中占有一席之地。其酶类主要有两大类：第一种是颗粒酶，结合在细胞膜上，如D-葡萄糖脱氢酶、甘油脱氢酶、D-山梨醇脱氢酶等，这些酶为黄素蛋白类或者细胞色素；第二种存在于胞质中，催化胞内碳水化合物的代谢。G.oxydans广泛应用于维生素C、5-脱氧野尻霉素、D-葡萄糖酸、2-羟基丙酮和醋酸等工业化生产，是国内外生物合成维生素C前体2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的关键菌株，具有非常高的工业价值。

目前国内在G.oxydans中的基因工程操作技术还不成熟，国内报道过的敲除手段都是利用卡那霉素等抗性基因作为筛选基因。此方法存在明显的弊端：将抗性基因引入G.oxydans基因组中，抗性基因对上下游基因会产生极性作用；一旦抗性基因引入基因组，则该抗性基因不可以再次用于G.oxydans染色体基因敲除和替代。

Upp基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶，能将5-氟尿嘧啶转化为5-氟尿苷一磷酸，5-氟尿苷一磷酸又转化为5-氟脱氧尿苷单磷酸，是胸苷酸合成酶的不可逆抑制剂，从而导致DNA不能修复和复制。因此，在培养基中加5-氟尿嘧啶可以筛选不含upp基因的菌株，由于upp基因缺失，培养基中添加胸腺嘧啶能使upp基因缺陷型G.oxydans更好地生长。采用upp基因为筛选基因在G.oxydans中进行基因敲除比使用抗性标记基因作为筛选标记进行基因敲除有以下两点优势：不将抗性基因引入G.oxydans基因组中，避免了抗性基因对上下游基因产生极性作用；利用该敲除体系可以在同一菌株中进行多次染色体基因敲除和替代。

采用upp基因为筛选基因在G.oxydans中进行基因敲除的技术以及敲除体系构建的方法国内未见有相关报道。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）无抗性标记基因敲除体系。

所述敲除体系包括一株upp基因缺陷型G.oxydans和一个携带了upp基因、抗生素抗性标记和多克隆位点的重组整合质粒。

所述upp基因（含启动子）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述upp基因缺陷型G.oxydans是将upp基因上下游各500bp片段同源臂通过融合PCR连接，得到upp基因敲除框架，转化G.oxydans后得到的upp缺陷型菌株。

所述upp基因上游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游500bp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

所述重组整合质粒，是将携带了upp基因的pMD19-T通过SacⅡ、ClaⅠ双酶切，将所得upp基因片段连接到pK19mobsacB上，得到重组整合质粒pK19mobupp（图1）。该质粒含有一个能在G.oxydans中良好转录表达并具有条件致死功能的upp基因、一个用于G.oxydans转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因，还含有一个MCS多克隆位点。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种应用所述敲除体系对G.oxydans进行基因敲除的方法，是将所需敲除的基因的敲除框架引入重组整合质粒的多克隆位点，得到重组整合载体，再将得到的重组整合载体转化upp缺陷型G.oxydans后，先后经抗生素抗性和抗5-氟尿嘧啶筛选得到目的基因缺陷型菌株。

具体地，所述方法可将upp基因通过SacⅡ、ClaⅠ双酶切后连接到pK19mobsacB上，得到重组整合质粒pK19mobupp，再将所需敲除的基因的敲除框架引入重组整合质粒的多克隆位点，然后电转化upp基因缺陷型G.oxydans，进行筛选：第一轮筛选是筛选具有卡那霉素抗性的转化子，第二轮筛选是筛选抗5-氟尿嘧啶及对卡那霉素敏感的转化子。