[发明专利]一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法

摘要

本发明公开了一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述植物乳杆菌的制备方法如下:(1)菌株的分离（2）菌株的纯化（3）抑酵母试验（4）菌株的药敏试验（5）菌株的鉴定。本发明的植物乳杆菌可以产生对多种病原菌和腐败菌具有抑制作用的细菌素，该细菌素具有很好的酸稳定性和热稳定性。通过上述制造的活性成分制造的菌剂对高水分苜蓿青贮时，高水分苜蓿水分含量高达81.7%，青贮时间达到240天；同时提高青贮剂的抑菌效果和降低耐药性借助青贮苜蓿进入食物链而传播的隐患。

主权项

一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述植物乳杆菌的制备方法如下:(1)菌株的分离：收集淤泥的浸出液，按体积比2:10的比例加入到无菌水中混匀，连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37℃厌氧培养45h；挑取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线4次得到纯的单菌落；挑取单菌落于没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中,观察是否产气,产气菌株为异型发酵乳酸菌,不产气菌株为同型发酵乳酸菌；（2）菌株的纯化：接入液体LB 培养基中，在14‑26℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，14‑26℃振荡培养至稳定期初期，将发酵液离心，取上清，滤纸过滤，得粗菌液；用截留分子量为12KDa 的膜包将粗菌液的体积浓缩至原来的1/10 ；浓缩后的菌液加硫酸铵至65‑70％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至85‑100％，离心取沉淀，在pH=7的KPB 缓冲液透析中放置24h；将透析后的菌液离心，取上清液，上样于已用pH=7 的KPB 缓冲液平衡好的CM‑Sepharose 预装柱，洗脱，收集有活性的部分，即为植物乳杆菌,‑20℃冻存；（3）抑酵母试验：取出‑20℃条件下保存的乳酸菌,取10微升注入MRS固体培养基上涂布, 在温度37℃的条件下培养15h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种于装有10mlMRS培养基的20ml试管中,在温度37℃的条件下培养17h，得到活化的乳酸菌；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中,装液量为100ml，37℃培养17h,此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993 × 10¹⁰ cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物一；将酵母菌于YPD液体培养基中28℃静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力； （4）菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法测定乳酸菌的药敏性，得到8株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株；（5）菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株进行生物学特性和16S‑23S rDNA间隔区序列鉴定。