[发明专利]一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法

权利要求书

1.一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述植物乳杆菌的制备方法如下:

(1)菌株的分离：收集淤泥的浸出液，按体积比2:10的比例加入到无菌水中混匀，连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37℃厌氧培养45h；挑取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线4次得到纯的单菌落；挑取单菌落于没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中,观察是否产气,产气菌株为异型发酵乳酸菌,不产气菌株为同型发酵乳酸菌；

（2）菌株的纯化：接入液体LB 培养基中，在14-26℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，14-26℃振荡培养至稳定期初期，将发酵液离心，取上清，滤纸过滤，得粗菌液；用截留分子量为12KDa 的膜包将粗菌液的体积浓缩至原来的1/10 ；浓缩后的菌液加硫酸铵至65-70％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至85-100％，离心取沉淀，在pH=7的KPB 缓冲液透析中放置24h；将透析后的菌液离心，取上清液，上样于已用pH=7 的KPB 缓冲液平衡好的CM-Sepharose 预装柱，洗脱，收集有活性的部分，即为植物乳杆菌,-20℃冻存；

（3）抑酵母试验：取出-20℃条件下保存的乳酸菌,取10微升注入MRS固体培养基上涂布, 在温度37℃的条件下培养15h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种于装有10mlMRS培养基的20ml试管中,在温度37℃的条件下培养17h，得到活化的乳酸菌；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中,装液量为100ml，37℃培养17h,此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993 × 10¹⁰ cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物一；将酵母菌于YPD液体培养基中28℃静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力； 

（4）菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法测定乳酸菌的药敏性，得到8株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株；

（5）菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株进行生物学特性和16S-23S rDNA间隔区序列鉴定。

2.根据权利要求1所述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述的步骤（1）或（3）中MRS 液体培养基为：蛋白胨12g，牛肉膏8g，酵母膏6g，L-光胱胺酸盐酸盐 0.08 g，柠檬酸氢三铵3g，葡萄糖25g，吐温80mL，乙酸钠6g，维生素K₂ 3g，磷酸氢二钾3g，硫酸镁0.8g，碳酸钙 12 g，硫酸锰0.3g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 值6-7。

3.根据权利要求1所述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述的步骤（1）或（3）中MRS固体培养基每升的组分及含量为: MRS液体培养基中加入质量百分比1.5%琼脂粉, pH值为6.5, 121℃灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述的步骤（2）中的发酵培养基的组成为：酵母粉0.3g/L，葡萄糖1.2g/L，硫酸铵2.5g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，氯化钾0.8g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸镁0.8g/L，pH=8-9。