[发明专利]一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物添加剂的制备方法，尤其涉及一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法。

背景技术

植物乳杆菌，植物乳杆菌是乳酸菌的一种，最适生长温度为30~35,厌氧或兼性厌氧,菌种为直或弯的杆状,单个、有时成对或成链状,最适pH 6. 5左右,属于同型发酵乳酸菌。此菌与别的乳酸菌的区别在于此菌的活菌数比较高，能大量的产酸，使水中的PH值稳定不升高，而且其产出的酸性物质能降解重金属。由于此菌是厌氧细菌（兼性好氧），在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂。在养殖中后期，由于动物的粪便和残饵料增加，会下沉到池塘的底部，并且腐烂，滋生很多病菌，生成大量的氨氮和亚硝酸盐，使底部偷死现象严重。如果长期使用植物乳酸杆菌，就能很好的抑制底部粪便和残饵料的腐烂，也就降低了氨氮和亚硝酸盐的增加，大量减少了化工降解素的用量，使养殖成本降低。

随着养殖业的不断发展以及粮食价格的攀升,开发品质优良、安全价廉的牧草饲料已成为转变养殖业经济增长方式的内在需求。苜蓿是草食动物优质的饲草,其主要产品是干草,但这种产品制作时常受到淋雨、落叶、价格昂贵的烘干设备以及消耗大量能源等问题的困扰，苜蓿青贮不仅可以免受以上困扰,还可减少养分损失以保持青绿饲料的营养特性。

因此，很多技术公开了苜蓿青贮的方法，但由于苜蓿自身的营养特征和菌落特征导致现有公开的技术或方法中苜蓿青贮的效果不理想，主要问题在于：一、一部分技术要求青贮时，,需要苜蓿萎蔫或晾晒至65%以下的含水量,这种含水量的要求将导致面临收获的雨季苜蓿无法进行青贮；二、苜蓿自身附有大量的酵母菌和少量的乳酸菌，苜蓿在青贮过程中需要使用繁殖快、抑菌强的乳酸菌添加剂，但添加乳酸菌剂的苜蓿青贮品在饲喂动物时将进入食物链，降低抗生素抗性的风险,需评价乳酸菌剂的抗生素抗性,即乳酸菌剂对抗生素的敏感性试验。    

鉴于上述苜蓿青贮用乳酸菌添加剂存在的问题以及苜蓿青贮时的特征,现有技术不能同时完成对高水分含量苜蓿进行青贮,同时提高青贮剂的抑菌效果和降低耐药性借助青贮苜蓿进入食物链而传播的隐患的问题。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明目的在于提供一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法。本发明提供了一种苜蓿青贮菌剂植物乳杆菌的制备方法，其特征在于,所述植物乳杆菌的制备方法如下:

(1)菌株的分离：收集淤泥的浸出液，按体积比2:10的比例加入到无菌水中混匀，连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37℃厌氧培养45h；挑取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线4次得到纯的单菌落；挑取单菌落于没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中,观察是否产气,产气菌株为异型发酵乳酸菌,不产气菌株为同型发酵乳酸菌；

（2）菌株的纯化：接入液体LB 培养基中，在14-26℃的条件下振荡培养至指数生长期，将处于指数生长期的菌液转接于液体发酵培养基中，14-26℃振荡培养至稳定期初期，将发酵液离心，取上清，滤纸过滤，得粗菌液；用截留分子量为12KDa 的膜包将粗菌液的体积浓缩至原来的1/10 ；浓缩后的菌液加硫酸铵至65-70％饱和度，离心取上清，继续加硫酸铵至85-100％，离心取沉淀，在pH=7的KPB 缓冲液透析中放置24h；将透析后的菌液离心，取上清液，上样于已用pH=7 的KPB 缓冲液平衡好的CM-Sepharose 预装柱，洗脱，收集有活性的部分，即为植物乳杆菌,-20℃冻存；

（3）抑酵母试验：取出-20℃条件下保存的乳酸菌,取10微升注入MRS固体培养基上涂布, 在温度37℃的条件下培养15h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种于装有10mlMRS培养基的20ml试管中,在温度37℃的条件下培养17h，得到活化的乳酸菌；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中,装液量为100ml，37℃培养17h,此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993 × 10¹⁰ cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物一；将酵母菌于YPD液体培养基中28℃静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力； 

（4）菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法测定乳酸菌的药敏性，得到8株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株；

（5）菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株进行生物学特性和16S-23S rDNA间隔区序列鉴定。