[发明专利]一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒

摘要

本发明公开一种牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测试剂盒，在双重PCR反应体系中引入指示假阴性的内标，通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，反应条件为：dNTP浓度为2.0mmol/L，Mg2+浓度为1.0mmol/L，Nc-5、GRA6和PRL三个基因所对应的上下游引物浓度分别为0.125mmol/L、0.5mmol/L和0.25mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5U；扩增条件为95℃5min；95℃30s，58℃45s，72℃30s，30个循环；最后经72℃延伸10min。本发明应用于对牛新孢子虫病与弓形虫病同步检测领域。

主权项

一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒按50次反应体系组装由以下成分组成：试剂盒反应体系为，0.5mL PCR扩增试剂混合液，包括Tris‑HCl pH8.4， 40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH4)SO4 20mmol/L、Mg2+4.0 mmol/L、dNTP4.0 mmol/L、引物Nc‑F/Nc‑R、GRA‑F/ GRA‑R和PRL‑F/ PRL‑R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L）；5U/μL Taq酶75U；去离子水1.0mL；所用的检测引物为：（1）新孢子虫检测引物：上游引物（Nc‑F）：GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG下游引物（Nc‑R）：CTCAACACAGAACACTGAACTCTCG可以扩增GeneBank登录号为X84238.1，469‑690位犬新孢子虫的Nc‑5基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.1；（2）弓形虫检测引物：上游引物（GRA‑F）：ATGATACAACCTCCGAAGCG下游引物（GRA‑R）：CGTCTTGTGCCCTGTTCTTC可以扩增GeneBank登录号为HM776942.1，265‑388位刚地弓形虫的GRA6基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.2；（3）监控内标检测引物：上游引物（PRL‑F）：TCAGCAAAGTATAAACCGATAGC下游引物（PRL‑R）：CAATCTCTATGGCCCTCGA  可以扩增GeneBank登录号为AF426315.1，8142‑8449位牛催乳素PRL基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.3。