[发明专利]一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒

说明书

 

技术领域

本发明涉及动物检验检疫技术领域，具体的，本发明涉及一种用于牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒的技术领域。

背景技术

牛新孢子虫病（Neosporosis）是由犬新孢子虫（Neospora caninum，N．caninum）寄生在宿主体内所引起的一种原虫病，该病的中间宿主为牛、绵羊、山羊、犬、马、鹿小鼠等温血动物，终极宿主为犬，主要造成孕畜流产、死胎及新生仔畜运动神经系统疾病，可垂直传播，一年四季均发病，该病对牛的危害尤为严重，是世界上许多地区造成奶牛流产、弱胎、死胎、木乃伊胎的主要原因之一。牛弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T. gondii）引起的一种人兽共患寄生虫病，猫为终宿主，人及动物为中间宿主，引起的流产可发生在奶牛妊娠的各阶段。这两种病呈世界性分布，给畜牧业造成巨大的经济损失。高效快速的检测方法，对于该病的早发现，早防治具有重要作用。 

目前，牛新孢子虫病和弓形虫病常用的检测方法有病理组织检测、病原学检测和血清抗体检测。但由于犬新孢子虫与刚地弓形虫的形态结构相似，二者都可以引起奶牛的流产、死胎以及神经系统障碍，且二者存在交叉抗原，有些血清学检测方法会出现交叉反应；临床上这两种病原常存在混合感染，且症状相近，往往难以区分检测。

PCR检测技术具有快速、灵敏、特异等优点，目前，已有很多采用PCR方法检测这两种病的报道。研究表明，临床标本如血清、全血、组织和分泌物等样品中含有大量的未知成分，会造成对PCR扩增的抑制，核酸抽提过程中试剂的残留也会抑制PCR扩增，从而导致假阴性结果或定量值偏低。另一方面，核酸提取过程中的丢失，也会造成假阴性结果。所以，对检测过程进行质量监控至关重要。

经检索，国内外未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便，且通过内标的添加，指示并校准假阴性结果，能够同时检测牛新孢子虫病与弓形虫病的内标多重PCR检测方法的报道。因此，探索和研究检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校准假阴性结果的方法，对于及时准确有效的检测新孢子虫病和弓形虫病，保护畜牧业健康发展、促进我国农产品出口和保护我国在国际贸易中的良好形象等方面均具有重要意义。

发明内容

针对目前国内外未见有关检测灵敏度高，特异性好，操作方便且能够指示并校正假阴性结果，提高检测结果的准确率，能够同时对牛新孢子虫病和弓形虫病进行检测的内标多重PCR方法，本发明提供一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，通过引物设计，用单重PCR扩增，获得了新孢子虫、弓形虫和扩增内标的PCR模板，并对反应条件进行了优化，建立了含有内标物的多重PCR检测体系，检测灵敏度高、特异性好、试验周期短，且能够指示并校正假阴性结果，实现了对牛新孢子虫病与弓形虫病单独检测或同步检测，且可对检测结果进行质量监控，从而实现对牛新孢子虫病和弓形虫病的灵敏、高效、快速、准确检测。 

本发明的主要技术方案：通过提供一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，建立了一种牛新孢子虫病和弓形虫病的检测方法，采用在双重PCR反应体系中引入指示假阴性的内标（internal amplification control，IAC），通过引物设计和PCR扩增，经反应条件优化，成功的建立了含有内标的多重PCR反应体系，可以对核酸提取和PCR扩增过程进行监测，显示抑制成分的存在，指示假阴性结果的发生，确保检测质量。

本发明具体提供一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，所述的试剂盒按50次反应体系组装由以下成分组成：试剂盒反应体系为，0.5mL PCR扩增试剂混合液，包括Tris-HCl pH8.4， 40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH₄)SO₄ 20mmol/L、Mg²⁺4.0 mmol/L、dNTP4.0 mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/ GRA-R和PRL-F/ PRL-R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L）；5U/μL Taq酶75U；去离子水1.0mL；所用的检测引物为：

（1）新孢子虫检测引物：

上游引物（Nc-F）：GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG