[发明专利]一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒

权利要求书

1.一种牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒按50次反应体系组装由以下成分组成：试剂盒反应体系为，0.5mL PCR扩增试剂混合液，包括Tris-HCl pH8.4， 40mmoL/L、KCl40mmol/L、(NH₄)SO₄ 20mmol/L、Mg²⁺4.0 mmol/L、dNTP4.0 mmol/L、引物Nc-F/Nc-R、GRA-F/ GRA-R和PRL-F/ PRL-R分别为0.25μmol/L、1μmol/L和0.5μmol/L）；5U/μL Taq酶75U；去离子水1.0mL；所用的检测引物为：

（1）新孢子虫检测引物：

上游引物（Nc-F）：GTTGCTCTGCTGACGTGTCGTTG

下游引物（Nc-R）：CTCAACACAGAACACTGAACTCTCG

可以扩增GeneBank登录号为X84238.1，469-690位犬新孢子虫的Nc-5基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.1；

（2）弓形虫检测引物：

上游引物（GRA-F）：ATGATACAACCTCCGAAGCG

下游引物（GRA-R）：CGTCTTGTGCCCTGTTCTTC

可以扩增GeneBank登录号为HM776942.1，265-388位刚地弓形虫的GRA6基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.2；

（3）监控内标检测引物：

上游引物（PRL-F）：TCAGCAAAGTATAAACCGATAGC

下游引物（PRL-R）：CAATCTCTATGGCCCTCGA  

可以扩增GeneBank登录号为AF426315.1，8142-8449位牛催乳素PRL基因特异性核苷酸序列，如SEQ ID NO.3。

2.如权利要求1所述牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的牛新孢子虫病与弓形虫病内标多重PCR检测试剂盒具体检测方法为：

（1）核酸的提取：按照抗凝全血血液基因组DNA提取系统进行操作提取核酸，组织样品经研磨后用DNAZol提取核酸，细胞培养物用DNAZol提取核酸，提取的核酸于-20 ℃保存备用；

（2）内标多重PCR扩增：多重PCR反应条件为：PCR扩增试剂10μL，DNA 2μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，补去离子水至20uL；扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s 58 ℃ 45s，72 ℃ 30 s，30个循环； 72 ℃ 延伸10 min；试验检测结束后，用浓度为25 g/L的琼脂糖凝胶电泳，80 V -100V，60min，观察结果；

（3）检测结果分析：被检样品同时扩增出大小为222 bp、124 bp和308bp的目的条带，表明该样品新孢子虫病和弓形虫病均为阳性；被检样品扩增出大小为308bp电泳条带，且有222 bp或124 bp任何一条电泳条带，扩增出222 bp条带，表明该样品新孢子虫病，扩增出124 bp条带，表明该样品弓形虫病，均为阳性；被检样品仅扩增出大小为308bp电泳条带，表明该样品新孢子虫病和弓形虫病均为阴性；被检样品不能扩展出大小为222 bp、124 bp和308bp中的任意一条电泳条带，表明反应中存在抑制成分，需重新进行检测。