[发明专利]一种水稻开花素重组蛋白的制备方法

摘要

本发明提供了一种水稻开花素重组蛋白的制备方法，所述方法包括RNA提取、重组载体制备、基因工程菌获得、重组蛋白分离纯化等步骤；实验证明，在本发明低温条件16～20℃下，诱导的蛋白可溶性明显增大，包涵体含量降低。本发明首次尝试了对植物开花素蛋白OsHd3a的原核表达，成功克隆了OsHd3a基因并构建了表达载体，重组质粒经酶切鉴定，再经测序确认序列正确，最后经过Ni-NTAResin分离纯化得到重组蛋白Hd3a，为将其应用于植物开花生理过程的调控提供了基础，对植物生产实践具有重要的意义。

主权项

一种水稻开花素重组蛋白的制备方法，所述方法包括：（1）取开花期水稻叶片，用液氮研磨后，提取总RNA；（2）以水稻总RNA为模板，用扩增引物进行RT‑PCR，PCR产物经电泳后凝胶回收，回收产物克隆至pMD18‑T，获得重组载体pMD18‑T‑OsHd3a；所述扩增引物序列如下：上游引物：5'‑CATATGGCCGGAAGTGGCAGGGACAG‑3'；下游引物：5'‑GGGGTAGACCCTCCTGCCGCCCTCGAG‑3'；（3）测序正确的重组载体pMD18‑T‑OsHd3a经限制性内切酶NdeI/XhoI酶切后，将含目的基因片段插入pET28b，构建重组表达载体pET28b‑OsHd3a，经过测序验证后转入大肠杆菌菌株BL21（DE3）；（4）含重组质粒的表达菌株BL21（DE3）在37℃活化培养后，挑取单菌落转入LB液体培养基中37℃振荡培养12h，所得菌液按照1:100体积比加入到含卡那霉素50μg/m L的LB液体培养基中，37℃、200r/min培养至OD600为0.4，加入终浓度0.50mmol/L的IPTG，20℃诱导培养至OD600为1.0；（5）步骤（4）所得菌液经分离纯化，得到所述水稻开花素重组蛋白。