[发明专利]一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法有效

专利信息
申请号: 201310302942.0 申请日: 2013-07-18
公开(公告)号: CN103333854A 公开(公告)日: 2013-10-02
发明(设计)人: 孙源超;陈春雷;李兰;沈伟 申请(专利权)人: 青岛农业大学
主分类号: C12N5/071 分类号: C12N5/071;C12N5/02
代理公司: 青岛高晓专利事务所 37104 代理人: 隋臻玮
地址: 266109 山东*** 国省代码: 山东;37
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摘要: 发明涉及一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法,首先分离绒山羊毛囊:剪下绒山羊背颈部皮肤,利用胶原酶IV消化,将毛囊结构分离并去除杂质;第二步,毛囊经培养液洗涤后,在消化液中消化为单细胞后过400目细胞筛转入毛囊干细胞培养液培养,以培养当天为零代,每3-4天传代一次;第三步,收集原代培养3-4天的毛囊干细胞克隆球,将原克隆球吹打至原大小1/2或1/4,将细胞悬液移至新培养液中,根据细胞密度按照1:2或1:3传代。本方法从有限的材料来源获得大量的毛囊干细胞,操作简便,可重复性好,培养的毛囊干细胞表达β-intigren,oct-4等,碱性磷酸酶阳性,显示毛囊干细胞具有多向分化潜能。
搜索关键词: 一种 绒山羊 毛囊 干细胞 体外 高效 培养 技术 方法
【主权项】:
一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法,其特征在于按照如下步骤操作:第一步,绒山羊毛囊的分离:剪取绒山羊背颈部皮肤,剪掉外侧毛发至根部,剪成小块后,置于生理盐水洗三遍,75%的酒精浸泡5分钟,转移至pH7.0磷酸盐缓冲液+10%胎牛血清的操作液中,在操作液中清洗,利用胶原酶IV在37℃下消化10‑15分钟,然后用手术镊子将毛囊结构分离出来,转移到前述操作液中,去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪杂质,在新鲜细胞培养液DMEM/F12中将毛囊洗3次;第二步,绒山羊毛囊干细胞体外原代培养:毛囊经DMEM/F12洗完后,置于0.25%Trypsin‑0.04%EDTA消化液,37℃消化20‑30分钟,轻轻吹打混匀,使毛囊周围的所有细胞变成单细胞或多细胞聚集物时,加入体积相当于消化液体积10%的胎牛血清终止消化,在DMEM/F12中清洗,过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养,毛囊干细胞培养液包含DMEM/F12;2%B27;20ng/ml表皮生长因子;40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子;1%青链霉素;以培养当天为零代,每3‑4天传代一次;第三步,绒山羊毛囊干细胞体外传代培养:收集原代培养3‑4天的毛囊干细胞克隆球至15ml离心管,离心后去掉上清液,加入0.5ml毛囊干细胞培养液,重悬吹打,稍用力将原克隆球吹打至原大小1/2或1/4,将吹打好的细胞悬液转移至新鲜毛囊干细胞培养液,根据细胞密度按照1:2或1:3传代;所述毛囊干细胞培养液成分同第二步。
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