[发明专利]一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法，属于生物医学的干细胞与组织工程学技术领域。 

背景技术：

干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。胚胎干细胞具有发育的全能性，但是它只存在于胚胎发育早期，因此其获得性以及伦理问题限制其进一步的研究及应用。 

成体干细胞虽然没有胚胎干细胞发育全能性上的优势，但是其取材方便，来源广泛，并且仍保留向多种细胞类型分化，因此成体干细胞的体外培养以及功能研究成为近年来研究的热点。毛囊干细胞是成体干细胞的一种，是一类具有自我更新能力及多向分化潜能的多能干细胞。这种细胞聚居于毛囊的隆突区，一旦需要，便可按特定发育途径分化产生出另外一群具有有限分裂能力的细胞群，是表皮、皮脂腺和毛囊细胞更新和修复的细胞来源。对毛囊干细胞的研究对于毛囊及附属器官再生及脱发，皮肤愈合及畜牧业生产具有重要意义。 

绒山羊是我国一种独特的生物资源，是经过长期的自然选择和人工选育而成的目前世界上产绒量最高、绒纤维品质最好的品种。因此绒山羊毛囊干细胞体外分离培养将对我们在理论上研究绒山羊毛囊干细胞的发育以及在实践中应用有重要意义。 

目前国内外研究中由于对组织内毛囊干细胞缺乏有效的分离培养方法，阻碍了该领域研究的深入发展。如何高效获得具有良好生物学性能的干细胞,，是目前毛囊干细胞研究急需解决的问题。 

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种绒山羊毛囊干细胞(Hair Follicle Stem Cell,HFSC)体外高效培养的技术方法。本发明方法分离1-2年绒山羊背颈部皮肤，拔取附着其上的毛囊，将毛囊消化为单细胞并过400目细胞筛后，体外培养毛囊干细胞，成功获得大量状态良好的毛囊干细胞。 

为了实现上述发明目的，本发明方法将绒山羊毛囊消化为单细胞后，采用悬浮培养方式，以无血清培养液培养，可以在体外获得大量毛囊干细胞的高效培养方法，按照如下步骤操作： 

第一步，绒山羊毛囊的分离：剪取绒山羊背颈部皮肤，剪掉外侧毛发至根部，剪成小块后，置于生理盐水洗三遍，75%的酒精浸泡5分钟，转移至磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.0）+10% 胎牛血清（FCS）的操作液中，在操作液中清洗，利用胶原酶IV在37℃下消化10-15分钟，然后用手术镊子将毛囊结构分离出来，转移到前述操作液中，去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪等杂质，在新鲜细胞培养液DMEM/F12（Dulbecco's Modified Eagle Medium，F-12Nutrient Mixture）中将毛囊洗3次； 

第二步，绒山羊毛囊干细胞体外原代培养：毛囊经DMEM/F12洗完后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化液，37℃消化20-30分钟，轻轻吹打混匀，使毛囊周围的所有细胞变成单细胞或多细胞聚集物时，加入体积相当于消化液体积10%的胎牛血清终止消化，在DMEM/F12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，毛囊干细胞培养液包含DMEM/F12；2%B27；20ng/ml表皮生长因子（EGF）；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；1%青链霉素；以培养当天为零代，每3-4天传代一次； 

第三步，绒山羊毛囊干细胞体外传代培养：收集原代培养3-4天的毛囊干细胞克隆球至15ml离心管，离心后去掉上清液，加入0.5ml毛囊干细胞培养液，重悬吹打，稍用力将原克隆球吹打至原大小1/2或1/4，将吹打好的细胞悬液转移至新鲜毛囊干细胞培养液中，根据细胞密度按照1:2或1:3传代。其中，所述毛囊干细胞培养液成分同第二步。 

本发明方法建立了绒山羊毛囊干细胞体外高效培养方法的技术方法，从有限的材料来源获得大量的毛囊干细胞，操作简便，可重复性好。为毛囊干细胞体外培养及研究应用提供了技术基础。 

附图说明：

图1为成年绒山羊背颈部皮肤毛囊的分离图。 

图2为绒山羊毛囊干细胞体外培养显微图。 

图3为绒山羊毛囊干细胞的碱性磷酸酶染色图。 

图4为绒山羊毛囊干细胞进行免疫荧光组织化学染色图。 

具体实施方式：

下面通过具体实施例和附图对本发明方法做进一步阐述。 

实施例1、