[发明专利]一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法

权利要求书

1.一种绒山羊毛囊干细胞体外高效培养的技术方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，绒山羊毛囊的分离：剪取绒山羊背颈部皮肤，剪掉外侧毛发至根部，剪成小块后，置于生理盐水洗三遍，75%的酒精浸泡5分钟，转移至pH7.0磷酸盐缓冲液+10%胎牛血清的操作液中，在操作液中清洗，利用胶原酶IV在37℃下消化10-15分钟，然后用手术镊子将毛囊结构分离出来，转移到前述操作液中，去除与毛囊连接在一起的皮脂腺、立毛肌、脂肪杂质，在新鲜细胞培养液DMEM/F12中将毛囊洗3次；第二步，绒山羊毛囊干细胞体外原代培养：毛囊经DMEM/F12洗完后，置于0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化液，37℃消化20-30分钟，轻轻吹打混匀，使毛囊周围的所有细胞变成单细胞或多细胞聚集物时，加入体积相当于消化液体积10%的胎牛血清终止消化，在DMEM/F12中清洗，过400目细胞筛后转入毛囊干细胞培养液培养，毛囊干细胞培养液包含DMEM/F12；2%B27；20ng/ml表皮生长因子；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子；1%青链霉素；以培养当天为零代，每3-4天传代一次；第三步，绒山羊毛囊干细胞体外传代培养：收集原代培养3-4天的毛囊干细胞克隆球至15ml离心管，离心后去掉上清液，加入0.5ml毛囊干细胞培养液，重悬吹打，稍用力将原克隆球吹打至原大小1/2或1/4，将吹打好的细胞悬液转移至新鲜毛囊干细胞培养液，根据细胞密度按照1:2或1:3传代；所述毛囊干细胞培养液成分同第二步。