[发明专利]海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法

摘要

本发明是海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法。本发明所产的酶属于胞内酶，该方法经超声波破碎、超速离心后可获得粗酶液；在温度37-40℃、pH6-8范围内，菌体具有较高的产酶能力。经(NH4)2SO4盐析去除杂质蛋白以及MonoQ阴离子交换柱的纯化，可以获得初步纯化的酶；酶在35-45℃、pH7.0-8.5范围内具有较高的活力；金属离子K+，Fe3+，Mg2+以及二硫苏糖醇DTT、乙二胺四乙酸EDTA能够促进酶的活性。本发明方法可操作性强，所产的酶比菌体适应范围更广，酶在自然条件下同样具有较高的活力，农药的降解率接近90%，具有更好的实际应用价值。

主权项

一种海洋细菌（Aranicola sp.）LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法，其特征在于，其步骤如下：（1）制备酶诱导培养基：以海水LB培养基为基础，制备酶诱导培养基；其组成如下：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，0.1%甲基对硫磷乳油，甲基对硫磷乳油中乳油的质量含量为50%，陈海水1000mL；分别称取胰蛋白胨、酵母提取物以及NaCl，用1000 mL陈海水定容，分装500 mL三角瓶，装液量100mL，121℃灭菌30min；采用0.22μm过滤膜对甲基对硫磷乳油过滤，在菌体接种之前加入；（2）产酶培养：按接种量2%向装液量为100mL的酶诱导培养基中接入海洋细菌LYG01，转速220r/min，37℃，培养36h，得发酵液；（3）粗酶液的制备：取发酵液，4℃，4000g 离心10min，收集菌体；取5g菌体，加入20mL 25 mM pH8.0预冷至4℃的Tris‑Cl缓冲液，超声波破碎，超声功率为150W，工作3s，间隔5s，超声时间为20min，得菌体破碎液，将菌体破碎液在4℃条件下，10000g 离心30min，保留上清液；将上清液进行超速离心，在4℃、100000 g条件下，离心60min，再次弃去沉淀，所得上清液即为粗酶液；（4）酶的分离纯化：对粗酶液依次进行(NH4)2SO4沉淀和Mono Q 阴离子交换层析处理；a、(NH4)2SO4沉淀：向粗酶液中加入pH8.0的100%饱和(NH4)2SO4溶液，使其最终饱和度为50%；缓慢振荡20min，10000g 离心30min，保留上清液；将上清液透析到25mM pH8.0 的Tris‑Cl缓冲液中，透析袋截留分子量为3000，透析时间2h；b 、Mono Q 阴离子交换层析：将(NH4)2SO4沉淀后的酶液进一步采用Mono Q 阴离子交换柱分离纯化；采用25mM pH8.0 的Tris‑Cl缓冲液平衡Mono Q 阴离子交换柱，上样，梯度洗脱，A泵贮液为25mM pH8.0 的Tris‑Cl，0.2 M NaCl，B泵贮液为25mM pH8.0 的Tris‑Cl，1M NaCl，流速0.5mL/min，收集得到甲基对硫磷水解酶。