[发明专利]海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法有效
申请号: | 201310220766.6 | 申请日: | 2013-06-05 |
公开(公告)号: | CN103320411A | 公开(公告)日: | 2013-09-25 |
发明(设计)人: | 李福后;王伟霞;陈丽;安贤惠;秦蕾 | 申请(专利权)人: | 淮海工学院 |
主分类号: | C12N9/16 | 分类号: | C12N9/16;C12R1/01 |
代理公司: | 南京众联专利代理有限公司 32206 | 代理人: | 毕东峰 |
地址: | 222000 江苏省连云港市新*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 海洋 细菌 lyg01 甲基 对硫磷 水解 方法 | ||
1.一种海洋细菌(Aranicola sp.)LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法,其特征在于,其步骤如下:
(1)制备酶诱导培养基:以海水LB培养基为基础,制备酶诱导培养基;其组成如下:1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,1%NaCl,0.1%甲基对硫磷乳油,甲基对硫磷乳油中乳油的质量含量为50%,陈海水1000mL;分别称取胰蛋白胨、酵母提取物以及NaCl,用1000 mL陈海水定容,分装500 mL三角瓶,装液量100mL,121℃灭菌30min;采用0.22μm过滤膜对甲基对硫磷乳油过滤,在菌体接种之前加入;
(2)产酶培养:按接种量2%向装液量为100mL的酶诱导培养基中接入海洋细菌LYG01,转速220r/min,37℃,培养36h,得发酵液;
(3)粗酶液的制备:取发酵液,4℃,4000g 离心10min,收集菌体;取5g菌体,加入20mL 25 mM pH8.0预冷至4℃的Tris-Cl缓冲液,超声波破碎,超声功率为150W,工作3s,间隔5s,超声时间为20min,得菌体破碎液,将菌体破碎液在4℃条件下,10000g 离心30min,保留上清液;将上清液进行超速离心,在4℃、100000 g条件下,离心60min,再次弃去沉淀,所得上清液即为粗酶液;
(4)酶的分离纯化:对粗酶液依次进行(NH4)2SO4沉淀和Mono Q 阴离子交换层析处理;
a、(NH4)2SO4沉淀:向粗酶液中加入pH8.0的100%饱和(NH4)2SO4溶液,使其最终饱和度为50%;缓慢振荡20min,10000g 离心30min,保留上清液;将上清液透析到25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液中,透析袋截留分子量为3000,透析时间2h;
b 、Mono Q 阴离子交换层析:将(NH4)2SO4沉淀后的酶液进一步采用Mono Q 阴离子交换柱分离纯化;采用25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液平衡Mono Q 阴离子交换柱,上样,梯度洗脱,A泵贮液为25mM pH8.0 的Tris-Cl,0.2 M NaCl,B泵贮液为25mM pH8.0 的Tris-Cl,1M NaCl,流速0.5mL/min,收集得到甲基对硫磷水解酶。
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