[发明专利]海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海洋细菌的产酶方法，特别是海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法。

背景技术

甲基对硫磷在我国广泛使用，该农药对多种农业害虫具有强烈的杀虫效果，对提高农作物产量具有重要的意义。但是，该农药使用后残留在土壤、水体、大气以及农产品中，造成严重的环境污染与生态破坏，并对人体健康造成严重威胁。

微生物能够降解甲基对硫磷等有机磷农药，这主要得益于它们能够产生甲基对硫磷水解酶，该酶能够水解甲基对硫磷，生成硫代磷酸以及对硝基苯酚等。目前已报道的产酶菌株主要有黄杆菌ATCC27551、缺陷假单胞菌MG、邻单胞菌M6等。与产酶菌株相比，甲基对硫磷水解酶具有更广泛的适用性，其对温度、pH值等条件更接近于实际环境。

甲基对硫磷水解酶具有多方面的用途，如在医学方面，治疗甲基对硫磷中毒患者；在环境保护方面，修复被农药污染的土壤以及水体；在食品方面，应用于生物传感器，检测食品的农药残留，保护餐桌安全等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的、操作简单、产酶效果好的海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是1．一种海洋细菌（Aranicola sp.）LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法，其特征在于，其步骤如下：

（1）制备酶诱导培养基：以海水LB培养基为基础，制备酶诱导培养基；其组成如下：1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，0.1%甲基对硫磷乳油，甲基对硫磷乳油中乳油的质量含量为50%，陈海水1000mL；分别称取胰蛋白胨、酵母提取物以及NaCl，用1000 mL陈海水定容，分装500 mL三角瓶，装液量100mL，121℃灭菌30min；采用0.22μm过滤膜对甲基对硫磷乳油过滤，在菌体接种之前加入；

（2）产酶培养：按接种量2%向装液量为100mL的酶诱导培养基中接入海洋细菌LYG01，转速220r/min，37℃，培养36h，得发酵液；

（3）粗酶液的制备：取发酵液，4℃，4000g 离心10min，收集菌体；取5g菌体，加入20mL 25 mM pH8.0预冷至4℃的Tris-Cl缓冲液，超声波破碎，超声功率为150W，工作3s，间隔5s，超声时间为20min，得菌体破碎液，将菌体破碎液在4℃条件下，10000g 离心30min，保留上清液；将上清液进行超速离心，在4℃、100000 g条件下，离心60min，再次弃去沉淀，所得上清液即为粗酶液；

（4）酶的分离纯化：对粗酶液依次进行(NH₄)₂SO₄沉淀和Mono Q 阴离子交换层析处理；

a、(NH₄)₂SO₄沉淀：向粗酶液中加入pH8.0的100%饱和(NH₄)₂SO₄溶液，使其最终饱和度为50%；缓慢振荡20min，10000g 离心30min，保留上清液；将上清液透析到25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液中，透析袋截留分子量为3000，透析时间2h；

b 、Mono Q 阴离子交换层析：将(NH₄)₂SO₄沉淀后的酶液进一步采用Mono Q 阴离子交换柱分离纯化；采用25mM pH8.0 的Tris-Cl缓冲液平衡Mono Q 阴离子交换柱，上样，梯度洗脱，A泵贮液为25mM pH8.0 的Tris-Cl，0.2 M NaCl，B泵贮液为25mM pH8.0 的Tris-Cl，1M NaCl，流速0.5mL/min，收集得到甲基对硫磷水解酶。

以下对本发明海洋细菌LYG01产甲基对硫磷水解酶的方法进行更为详细的说明。

1  材料

1.1 菌株

    海洋细菌（Aranicola sp.）LYG01，分离自连云港海域。该菌株已于2010年6月9号在Genbank公开，登录号为HM116540，登陆网址为：（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HM116540）。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日期起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。

1.2 酶诱导培养基