[发明专利]以整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法

摘要

本发明公开了一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产海藻糖合成酶并将此酶用于生产海藻糖的方法。具体是将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产海藻糖合成酶。经过简单分离，发酵液中的海藻糖合成酶能够直接用于海藻糖的制造。本发明的优点是：本发明利用食品安全的表达系统生产海藻糖合成酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，表达的海藻糖合成酶分泌到胞外，无抗菌活性，达到食品应用酶制剂要求，有利于下一步海藻糖的制造。

主权项

一种能够以整合型的方式表达海藻糖合成酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为：将海藻糖合成酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；所述的海藻糖合成酶表达元件包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和海藻糖合成酶基因；所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β‑淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌（Bacillus brevis）的ɑ‑乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断；所述的海藻糖合成酶基因为来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)的海藻糖合成酶基因，来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶基因,或来源于水栖嗜热菌（Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶基因，所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83及其衍生质粒；所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751, WB600,和WB800。