[发明专利]以整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是以整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法，并将生产得到的海藻糖合成酶用于制造海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖是由两分子葡萄糖以α,α-1,1-糖苷键相连而成，在自然界中广泛存在的天然性二糖。它自身性质非常稳定，并对多种生物活性物质具有保护作用。近年来，研究发现海藻糖能广泛应用于各类食品的鲜味保持及质地改善。随着社会的进步和人们生活水平的提高，人们对食品的质量和口感日趋重视，这加大了人们对海藻糖的需求。因此，大规模的廉价高效生产海藻糖具有极大的经济价值，同时也将更能推广和普及海藻糖在食品领域的使用。

研究已发现自然界中有多种酶系能够合成海藻糖。其中一种是在许多微生物中都能发现的海藻糖合成酶（Trehalose Synthase）。此酶能够将麦芽糖直接转化成为海藻糖，比较适宜应用于工业化生产海藻糖。研究已发现来源于脂肪杆菌（Pimelobacter species),弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata),谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)，耐放射性异常球菌（Deinococcus radiodurans）以及水栖嗜热菌（Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶能够高效的将麦芽糖转化成为海藻糖。目前，已有的成功报道都是直接从原始菌株中培养分离，或者利用重组质粒在大肠杆菌中表达。从原始菌株中培养分离往往因为原始菌株表达的酶活不高而影响大规模生产，而大肠杆菌表达系统也存在一些缺陷，如含有内毒素、肠毒素、难以分泌表达，产物需要破胞提取等，而且为了保持质粒的稳定性，在生产过程中一般需要使用抗生素。为了避免重组微生物发酵过程中残留的抗生素类物质对于食品安全的影响，国际上对微生物来源的酶制剂的抗菌活性有严格限制，中国在食品工业用酶制剂的食品安全国家标准（GB 25594—2010）中也明确规定微生物来源的酶制剂不得检出抗菌活性，这对食品用酶制剂提出了更高的要求。

枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，不产内毒素和致热致敏蛋白质，是一种食品安全的菌种。另外，枯草芽孢杆菌表达系统还具有以下优点：1、具有很强的蛋白质分泌功能，不需要破碎细胞来提取蛋白质，只需要较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质。2、没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包函体。3、发酵条件简单。因此，开发利用枯草芽孢杆菌表达系统生产食品添加剂具有深远的意义和广阔的市场前景。根据所采用载体类型不同，枯草芽孢杆菌表达模式可分为可复制质粒表达和染色体整合表达。复制质粒通常在枯草芽孢杆菌中不很稳定，这限制了外源基因的高效表达。同时也存在着在生产过程中需要使用抗生素的问题。目前还没有发现利用整合型枯草芽孢杆菌表达系统表达生产海藻糖合成酶，进而利用获得的海藻糖合成酶制造海藻糖的研究报告。

发明内容

本发明的目的是提供一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产海藻糖合成酶并利用获得的海藻糖合成酶制造海藻糖的方法。利用整合质粒将海藻糖合成酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中，构建整合型重组枯草芽孢杆菌，利用该菌在液体培养基中进行发酵，得到海藻糖合成酶。经过简单分离,发酵液中的海藻糖合成酶能够直接用于海藻糖的制造.

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

1.一种能够以整合型的方式表达海藻糖合成酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为：

将海藻糖合成酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；

所述的海藻糖合成酶表达元件包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和海藻糖合成酶基因；

所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；

所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌（Bacillus brevis）的ɑ-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断；