[发明专利]以整合型重组枯草芽孢杆菌生产海藻糖合成酶及制造海藻糖的方法

权利要求书

1.一种能够以整合型的方式表达海藻糖合成酶的重组枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，其获得方法为：

将海藻糖合成酶表达元件克隆到枯草芽孢杆菌整合质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，挑选外源基因通过双交换整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组枯草芽孢杆菌；

所述的海藻糖合成酶表达元件包含如下组分：能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断和海藻糖合成酶基因；

所述的能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子为来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；

所述的能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断为来源于高温产硫化氢梭状芽孢杆菌(Clostridium thermosulfurogenes)的β-淀粉酶基因信号肽DNA片断，或来源于短芽孢杆菌（Bacillus brevis）的ɑ-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断；

所述的海藻糖合成酶基因为来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum)的海藻糖合成酶基因，来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶基因,或来源于水栖嗜热菌（Thermus aquaticus)的海藻糖合成酶基因，

所述的枯草芽孢杆菌整合质粒为整合质粒pMLK83及其衍生质粒；

所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，包括1A751,WB600,和WB800。

2.一种利用权利要求1所述的的重组枯草芽孢杆菌菌株来生产海藻糖合成酶及制备海藻糖的方法，其特征在于，工艺步骤如下：

1）一级种的制备：从含新霉素20ug/ml的LB平板上接上述枯草芽孢杆菌基因工程菌株单菌落在4ml LB液体培养基37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种；

2）二级种的制备：一级种接种于800ml LB液体培养基，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6左右（约4～5小时）；

3）三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控pH7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30%，培养至OD600为0.6左右（约5～6小时）；

4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36～38℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30%，以柠檬酸、NaOH控pH 6～8,培养约26小时,10000g离心力离心除菌,用截留分子量5000～10000超滤膜浓缩上清液后，即得海藻糖合成酶浓缩原液；

5）以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，通过常规酶法转化生产海藻糖的方法利用上述重组海藻糖合成酶溶液制造海藻糖。