[发明专利]检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法

摘要

本发明公开了一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，按照如下步骤完成：a、锁式探针的环化连接与酶切；b、第一轮RCA；c、RCA产物的酶切；d、锁式探针的连接；e、第二轮RCA，再用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果。本发明锁式探针结合RCA技术是一种检测基因位点突变的新方法，通过锁式探针特异识别靶基因的点突变位点，RCA扩增放大检测信号，并且通过RCA双循环扩增更加放大了检测信号。该方法不需特殊设备、操作简单、特异性好、灵敏度高，在病原体耐药位点突变检测方面具有独特优势。

主权项

一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：a、锁式探针的环化连接与酶切：去离子水12μl、1μmol/L的锁式探针2μl、模板2μl和10×E.coli Buffer2μl，混匀，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease I Buffer2μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；b、第一轮RCA：取步骤a中制得的探针环化连接产物24μl、100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer3μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；c、RCA产物的酶切：取步骤b制得的第一轮RCA扩增产物30μl、10×Hpa I Buffer3.5μl和HpaI核酸内切酶1.5μl，混匀后37℃酶切12h；酶切产物95℃孵育5min，冰浴1min后备用；d、锁式探针的连接：取步骤c制得的酶切的RCA产物35μl、1μM锁式探针1μl和10×E.coli Buffer4.5μl，混匀，45℃孵育40min；加入10×BSA缓冲液4.5μl和0.4μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；加入10×Exonuclease I Buffer5μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；e、第二轮RCA：取步骤d制得的环化连接产物50μl、100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer6μl，95℃孵育5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合 酶2μl和dNTP液1μl，混匀，37℃进行RCA反应2h；f、取步骤e制得的扩增产物5μl用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；所述步骤a和e中所设计用于RCA反应的引物是：引物5′‑ATGGGCACCGAAGAAGCA‑3′               SEQ N01；探针是：锁式探针5‑CCTACGAACCACTGAACTGCTTCTTCGGTGCCCATACATCAAATGCCACGTTAACA GTCAGGCCTAGTGGGGGAAAGC‑3′，探针的5′端进行磷酸化修饰SEQ N02。