[发明专利]检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法。

背景技术

病原微生物对抗菌药物的耐受大大降低了抗菌药物的治疗效果，已成为临床感染性疾病治疗面临的刺手问题。研究表明，病原微生物的基因突变是其产生耐药性的根本原因。细菌、真菌等病原微生物的耐药性可以通过耐药基因检测和体外药敏实验进行监测，但HBV、HCV等病毒尚无体外药敏实验，只能进行耐药基因检测。因此，耐药位点检测在各种感染性疾病的治疗中，对于指导抗感染药物的选择和合理应用具有重要临床价值。目前，基因突变位点检测有测序法、芯片杂交法等。基因测序方法繁琐，费用昂贵，耗时长；芯片杂交以PCR技术为基础，易出现假阳性。滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是一种恒温线性扩增技术，以其快速简易、灵敏度高和特异性强等优点受到广泛关注。锁式探针由5’端模板结合区、中间连接序列区和3’端模板结合区组成。其中3’端末端碱基一般为突变位点识别区。当5’端和3’端与模板完全互补时，探针两端在DNA连接酶的作用下形成磷酸二酯键被连接成环，为RCA扩增提供环形模板，后者与引物杂交并在DNA聚合酶的作用下启动滚环扩增反应，形成一条含大量环形模板互补重复序列的DNA单链。当5’端和3’端与模板不能完全配对时，探针无法连接成环而保持线状，也就不会发生RCA扩增反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法,该检测方法操作简单、检测时间周期短、检测费用少，通过双循环RCA扩增和锁式探针相结合，能够准确的检测出乙型肝炎病毒耐药基因的方法。

本发明的技术方案如下：一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，按照如下步骤完成：

a、锁式探针的环化连接与酶切：去离子水12μl、1μMol/L的锁式探针2μl、模板2μl和10×E.coliBuffer2μl，混匀，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μlE.coliDNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease I Buffer2μl和ExonucleaseI核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活ExonucleaseI核酸外切酶；

b、第一轮RCA：取步骤a中制得的探针环化连接产物24μl、100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer3μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；

c、RCA产物的酶切：取步骤b制得的第一轮RCA扩增产物30μl、10×Hpa I Buffer3.5μl和HpaI核酸内切酶1.5μl，混匀后37℃酶切12h；酶切产物95℃孵育5min，冰浴1min后备用；

d、锁式探针的连接:取步骤c制得的酶切的RCA产物35μl、1μM锁式探针1μl和10×E.coli Buffer4.5μl，混匀，45℃孵育40min；加入10×BSA缓冲液4.5μl和0.4μlE.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；加入10×Exonuclease I Buffer5μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；

e、第二轮RCA：取步骤d制得的环化连接产物50μl、100μMol/L引物1μl和10×phi29Buffer6μl，95℃孵育5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶2μl和dNTP液1μl，混匀，37℃进行RCA反应2h；

f、取步骤e制得的扩增产物5μl用1.0%的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；

所述步骤a和e中所设计用于RCA反应的引物是：

引物5′-ATGGGCACCGAAGAAGCA-3′               SEQ NO1；

探针是：

锁式探针

5′

-CCTACGAACCACTGAACTGCTTCTTCGGTGCCCATACATCAAATGCCACGTTAACAG TCAGGCCTAGTGGGGGAAAGC-3′，探针的5′端进行磷酸化修饰

SEQ NO2。