[发明专利]检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法

权利要求书

1.一种检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，其特征在于，按照如下步骤完成：

a、锁式探针的环化连接与酶切：去离子水12μl、1μmol/L的锁式探针2μl、模板2μl和10×E.coli Buffer2μl，混匀，45℃孵育40min后，加入10×BSA缓冲液2μl和0.2μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；再加入10×Exonuclease I Buffer2μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；

b、第一轮RCA：取步骤a中制得的探针环化连接产物24μl、100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer3μl，95℃5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶1μl、dNTP液1μl，混匀后37℃进行RCA反应2h；

c、RCA产物的酶切：取步骤b制得的第一轮RCA扩增产物30μl、10×Hpa I Buffer3.5μl和HpaI核酸内切酶1.5μl，混匀后37℃酶切12h；酶切产物95℃孵育5min，冰浴1min后备用；

d、锁式探针的连接：取步骤c制得的酶切的RCA产物35μl、1μM锁式探针1μl和10×E.coli Buffer4.5μl，混匀，45℃孵育40min；加入10×BSA缓冲液4.5μl和0.4μl E.coli DNA连接酶，混匀，37℃进行环化连接反应40min；加入10×Exonuclease I Buffer5μl和Exonuclease I核酸外切酶2μl，混匀，37℃反应1h，最后在95℃条件下灭活Exonuclease I核酸外切酶；

e、第二轮RCA：取步骤d制得的环化连接产物50μl、100μmol/L引物1μl和10×phi29Buffer6μl，95℃孵育5min，冰浴1min；加入phi29DNA聚合酶2μl和dNTP液1μl，混匀，37℃进行RCA反应2h；

f、取步骤e制得的扩增产物5μl用1.0％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像仪观察电泳结果；

所述步骤a和e中所设计用于RCA反应的引物是：

引物5′-ATGGGCACCGAAGAAGCA-3′               SEQ N01；

探针是：

锁式探针

5-CCTACGAACCACTGAACTGCTTCTTCGGTGCCCATACATCAAATGCCACGTTAACA GTCAGGCCTAGTGGGGGAAAGC-3′，探针的5′端进行磷酸化修饰

SEQ N02。

2.根据权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒耐药基因的双循环RCA方法，其特征在于：所述锁式探针中间序列加入HpaI核酸内切酶的酶切位点-GTTAAC-。