[发明专利]甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光传感器的制备及应用

摘要

本发明提供了一种甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光传感器的制备及应用，属于纳米功能材料、临床分析、生物传感技术和电化学技术领域。本发明利用铂纳米粒子@介孔硅@石墨烯纳米复合材料（PtNPs@M-Si@GS）导电能力强、稳定性好、比表面积大、生物相容性好、催化活性强等特点，标记甲胎蛋白二抗（anti-AFP）和癌胚抗原的二抗（anti-CEA），从而制得标记二抗Ru-PtNPs@M-Si@GS/anti-AFP和luminol-PtNPs@M-Si@GS/anti-CEA，显著提高了传感器的灵敏度。与其它单通道电极传感器相比，可以在同一支电极上一次性同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原，显著提高了检测效率，对临床早期诊断肝癌具有重要的科学意义和应用价值。

主权项

甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）铂纳米粒子@介孔硅@石墨烯纳米复合材料（PtNPs@M‑Si@GS）的制备将6~10 mL、2.66 mg/mL氧化石墨烯，0.4~0.6 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），20 mg氢氧化钠和42 mL超纯水混合，超声30~50 min；35~45℃下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯（TEOS）乙醇溶液，反应10~12 h；加入80 mL、质量分数为85%的水合肼，65~75℃加热3 h，乙醇离心洗涤三次；将产品溶于丙酮中搅拌24 h，离心三次；将产品溶于50 mL乙醇中，加入150~250 µL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），搅拌10~12 h，离心分离；将产品溶于42.5 mL水，得到氨基化介孔硅@石墨烯纳米复合材料（M‑Si@GS）；将3~5 mL M‑Si@GS水溶液和40~60 mL铂纳米粒子溶液混合，搅拌2~4 h，离心分离两次，真空干燥，得到PtNPs@M‑Si@GS；所述的TEOS乙醇溶液是由350~450 μL TEOS溶于1.6 mL的乙醇中制得；（2）标记二抗（Ru‑PtNPs@M‑Si@GS/anti‑AFP和luminol‑PtNPs@M‑Si@GS/anti‑CEA）溶液的制备将0.5~1.5 mg的PtNPs@M‑Si@GS分别加入到1~2 mL、1×10‑3 mol/L三联吡啶钌（Ru(bpy)3Cl2）溶液和1~2 mL、1×10‑3 mol/L鲁米诺（luminol）溶液中，超声1~3 h，搅拌6~10 h，离心分离，得到二抗标记物Ru‑PtNPs@M‑Si@GS和luminol‑PtNPs@M‑Si@GS；将所制得的二抗标记物Ru‑PtNPs@M‑Si@GS加入到1 mL、5~10 µg/mL甲胎蛋白抗体（anti‑AFP）溶液中，在4℃下震荡孵化20~24 h，离心去除上清液，加入1 mL、pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗Ru‑PtNPs@M‑Si@GS/anti‑AFP溶液储存在4℃的冰箱中备用；将所制得的二抗标记物luminol‑PtNPs@M‑Si@GS加入1 mL、5~10 µg/mL 癌胚抗原抗体（anti‑CEA）溶液中，在4℃下震荡孵化20~24 h，离心去除上清液，加入1 mL、pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗luminol‑PtNPs@M‑Si@GS/anti‑CEA溶液，储存在4℃的冰箱中备用；（3）甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法1）在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干；2）在1）中得到的工作电极的表面上滴加5~10 µL抗体混合溶液，室温下孵化2~3 h，然后用超纯水清洗，晾干；所述抗体混合溶液含甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体的浓度均为5~10 µg/mL；3）用超纯水洗去没有交联上的所述甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体，滴加质量分数为0.5%~1%的牛血清白蛋白溶液， 37℃下放置1~2 h，用pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4℃下储存备用，制得甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器。