[发明专利]甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光传感器的制备及应用

权利要求书

1.甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料（PtNPsM-SiGS）的制备

将6~10 mL、2.66 mg/mL氧化石墨烯，0.4~0.6 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），20 mg氢氧化钠和42 mL超纯水混合，超声30~50 min；35~45℃下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯（TEOS）乙醇溶液，反应10~12 h；加入80 mL、质量分数为85%的水合肼，65~75℃加热3 h，乙醇离心洗涤三次；将产品溶于丙酮中搅拌24 h，离心三次；将产品溶于50 mL乙醇中，加入150~250 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），搅拌10~12 h，离心分离；将产品溶于42.5 mL水，得到氨基化介孔硅石墨烯纳米复合材料（M-SiGS）；

将3~5 mL M-SiGS水溶液和40~60 mL铂纳米粒子溶液混合，搅拌2~4 h，离心分离两次，真空干燥，得到PtNPsM-SiGS；

所述的TEOS乙醇溶液是由350~450 μL TEOS溶于1.6 mL的乙醇中制得；

（2）标记二抗（Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP和luminol-PtNPsM-SiGS/anti-CEA）溶液的制备

将0.5~1.5 mg的PtNPsM-SiGS分别加入到1~2 mL、1×10^-3 mol/L三联吡啶钌（Ru(bpy)₃Cl₂）溶液和1~2 mL、1×10^-3 mol/L鲁米诺（luminol）溶液中，超声1~3 h，搅拌6~10 h，离心分离，得到二抗标记物Ru-PtNPsM-SiGS和luminol-PtNPsM-SiGS；

将所制得的二抗标记物Ru-PtNPsM-SiGS加入到1 mL、5~10 μg/mL甲胎蛋白抗体（anti-AFP）溶液中，在4℃下震荡孵化20~24 h，离心去除上清液，加入1 mL、pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP溶液储存在4℃的冰箱中备用；

将所制得的二抗标记物luminol-PtNPsM-SiGS加入1 mL、5~10 μg/mL 癌胚抗原抗体（anti-CEA）溶液中，在4℃下震荡孵化20~24 h，离心去除上清液，加入1 mL、pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，得到标记二抗luminol-PtNPsM-SiGS/anti-CEA溶液，储存在4℃的冰箱中备用；

（3）甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法

1）在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干；

2）在1）中得到的工作电极的表面上滴加5~10 μL抗体混合溶液，室温下孵化2~3 h，然后用超纯水清洗，晾干；

所述抗体混合溶液含甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体的浓度均为5~10 μg/mL；

3）用超纯水洗去没有交联上的所述甲胎蛋白抗体和癌胚抗原抗体，滴加质量分数为0.5%~1%的牛血清白蛋白溶液， 37℃下放置1~2 h，用pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4℃下储存备用，制得甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器。

2.如权利要求1所述甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器，用于甲胎蛋白和癌胚抗原的同时检测，步骤如下：

（1）把已知浓度的甲胎蛋白和癌胚抗原溶液加入到40~60 μL、pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取10~15 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置1~2 h；

（2）将Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP溶液和luminol-PtNPsM-SiGS/anti-CEA溶液等体积混合，制得标记二抗混合溶液，滴涂5~7μL 标记二抗混合溶液到工作电极表面上，1~2 h后用pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液洗去未结合上的标记二抗，得到组装的工作电极；

（3）将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入5~15 mL、20~30 mmol/L三乙醇胺空气饱和的pH=7.0~7.8的PBS缓冲溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP和luminol-PtNPsM-SiGS/anti-CEA分别在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和癌胚抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

（4）将待测样品溶液代替甲胎蛋白和癌胚抗原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和癌胚抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。