[发明专利]甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光传感器的制备及应用

说明书

技术领域

本发明属于纳米功能材料、临床分析、生物传感技术和电化学技术领域，提供了一种甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光传感器的制备及应用。

背景技术

肿瘤的早期诊断、早期治疗是提高癌症患者生存率的关键。肿瘤标志物的检测可反映肿瘤的生物学特性，对指导治疗、辅助诊断、判断预后均有重要意义。单一的肿瘤标志物可能敏感性、准确性不够高，器官特异性不够强。联合检测可弥补单指标检测的不足，提高了肿瘤诊断的敏感性、准确性和特异性。

肝癌是危及生命的常见病，早期发现、早期诊断是早期治疗的基础和前提，也是有效提高肝癌患者生存率、改善其预后的重要保证。由于癌瘤早期体积微小，肝脏又隐匿于上腹深部，有肋骨做屏障，采用B超、CT扫描等手段均难以早期发现，而且肝脏具有强大的代偿功能，早期常无临床症状，也给肝癌的早期诊断带来困难。

联合检测血清甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）肿瘤标志物不仅可用于肝癌的早期诊断，而且也有助于原发性肝癌的鉴别诊断。

随着近年来纳米技术的快速发展，各种无机纳米材料如碳纳米管、金属纳米粒子、金属氧化物、半导体和石墨烯等已用于电致化学发光免疫传感器的构建。

石墨烯（GrapheneSheets，GS）是一种单层、片状的二维结构，近年来成为理论和实践关注的焦点。介孔材料由于大的比表面积及良好的生物相容性也被广泛的关注。另外，金属纳米材料由于其独特的性质和优点，如导电性好、催化活性高、比表面积大，而被广泛应用于电化学传感器的增敏方面。

本发明制作了单电极双通道电致化学发光免疫传感器，首先在工作电极上修饰纳米介孔金，用来固载甲胎蛋白和癌胚抗原的一抗。

采用双抗体夹心免疫分析方法，对二抗的标记方法进行了探讨。采用铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料作为二抗标记物载体，三联吡啶钌和鲁米诺分别用来标记甲胎蛋白二抗和癌胚抗原二抗，在底液中加入三乙醇胺，在不同的电压下，三联吡啶钌与三乙醇胺反应产生电致化学发光信号1，鲁米诺与溶解氧产生电致化学发光信号2，制备出性能优良、灵敏度高的同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原双通道电致化学发光免疫传感器。

本发明采用一支玻碳电极，结合电致化学发光技术，实现在一支玻碳电极上实现双通道测定；结合免疫技术，提高了传感器的选择性；该方法节省时间，是一种快速、特异、灵敏的检测方法。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法。

本发明的目的之二是将所制备的电致化学发光免疫传感器，用于同时检测甲胎蛋白和癌胚抗原。

本发明的技术方案，包括以下步骤。

1. 甲胎蛋白和癌胚抗原电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料（PtNPsM-SiGS）的制备

将6~10 mL、2.66 mg/mL氧化石墨烯，0.4~0.6 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），20 mg氢氧化钠和42 mL超纯水混合，超声30~50 min；35~45℃下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯（TEOS）乙醇溶液，反应10~12 h；加入80 mL、质量分数为85%的水合肼，65~75℃加热3 h，乙醇离心洗涤三次；将产品溶于丙酮中搅拌24 h，离心三次；将产品溶于50 mL乙醇中，加入150~250 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），搅拌10~12 h，离心分离；将产品溶于42.5 mL水，得到氨基化介孔硅石墨烯纳米复合材料（M-SiGS）。

将3~5 mL M-SiGS水溶液和40~60 mL铂纳米粒子溶液混合，搅拌2~4 h，离心分离两次，真空干燥，得到PtNPsM-SiGS。

所述的TEOS乙醇溶液是由350~450 μL TEOS溶于1.6 mL的乙醇中制得。

（2）标记二抗（Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP和luminol-PtNPsM-SiGS/anti-CEA）溶液的制备

将0.5~1.5 mg的PtNPsM-SiGS分别加入到1~2 mL、1×10^-3 mol/L三联吡啶钌（Ru(bpy)₃Cl₂）溶液和1~2 mL、1×10^-3 mol/L鲁米诺（luminol）溶液中，超声1~3 h，搅拌6~10 h，离心分离，得到二抗标记物Ru-PtNPsM-SiGS和luminol-PtNPsM-SiGS。