[发明专利]一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法

摘要

一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明包括如下步骤：邻苯二甲酸与6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基，形成半抗原，再与载体蛋白上的氨基进行偶联，得到邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原。实验结果表明，用本发明的抗原免疫动物得到的抗血清效价可达160000，对DBP、DEHP，DINP的半抑制浓度IC50均小于500ng/mL，产生的抗体通用性好，灵敏度高。本发明的抗原或抗体可用于建立酶联免疫吸附分析方法和胶体金试纸快速检测法，从而用于快速检测食品中的邻苯二甲酸酯类塑化剂残留，具有广阔的应用前景。

主权项

一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，其特征在于：以邻苯二甲酸与6‑(芴甲氧羰酰基‑氨基)‑1‑己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基，形成半抗原，半抗原通过1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N‑羟基琥珀酰亚胺NHS活化，或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联，得到邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原，步骤如下：（1）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原的制备取0.5～1g邻苯二甲酸，1mL6‑(芴甲氧羰酰基‑氨基)‑1‑己醇，钛酸四丁酯10μL，二环己基碳二亚胺DCC10mg，95℃反应12h，加入NaOH水溶液，中和反应液至pH7.4～8，分层后弃水相，有机相再洗涤一次，减压35℃旋蒸脱醇；在产物中加入10mL含20%哌啶的N,N‑二甲基甲酰胺DMF溶液，室温反应20min，脱去芴甲氧羰酰基保护基团，得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原；（2）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原的制备取邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原加入N,N‑二甲基甲酰胺DMF溶解，4℃下加入2.5%戊二醛溶液，半抗原:戊二醛的摩尔比为1:1.5，避光混匀搅拌反应1h，得活化的半抗原溶液；取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6碳酸盐缓冲液溶解,其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N‑二甲基甲酰胺DMF的体积比例为5:1；在0℃下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃反应1h，室温下反应6h；用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原。