[发明专利]一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法

说明书

技术领域

一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。 

背景技术

塑化剂（Plasticizer），是一种增加材料的柔软性或是材料液化的添加剂。其中最常见的塑化剂是邻苯二甲酸酯类物质（Phthalate Esters, PAEs），是邻苯二甲酸的酯化衍生物。 

邻苯二甲酸酯塑化剂是具些许芳香气味或无气味的无色液体，中等黏度、高稳定性、低挥发性、成本低廉、低水溶解度，但易溶于多数有机溶剂中。邻苯二甲酸酯类在日常及工业上被广泛使用，以邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）为最大宗，占塑化剂产量的四分之三，其次是邻苯二甲酸二丁酯（DBP）。邻苯二甲酸酯类塑化剂被归类为疑似环境荷尔蒙，其生物毒性主要属雌激素与抗雄激素活性，会造成内分泌失调，阻害生物体生殖机能，包括生殖率降低、流产、天生缺陷、异常的精子数、睪丸损害，还会引发恶性肿瘤、造成畸形儿。 

目前我国对邻苯二甲酸酯塑化剂的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC/MS）、酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、胶体金试纸条法等。仪器分析方法存在样品须经多步稀释、过滤、提取，制备复杂、繁琐的缺点。尽管仪器分析方法是邻苯二甲酸酯塑化剂检测的确证方法，但是由于其操作繁琐，以及长时间的样本前处理过程，导致检测成本高，周期长，无法满足大批量样本快速筛查，以及现场快速检测的要求。ELISA和胶体金试纸条法属于免疫分析技术，具有较高的灵敏度和特异性，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。 

影响免疫分析方法的关键因素在于特异性的抗原和抗体。目前常见的方法是在邻苯二甲酸酯的苯环上引入活性氨基然后与载体蛋白偶联，暴露出邻苯二甲酸酯类的侧链基团为抗原决定簇，此种方法得到的完全抗原通过免疫后，只对特定的邻苯二甲酸酯物质产生较好的抑制效果，交叉反应率较小，得到的抗体无法用于邻苯二甲酸酯类的通用检测。 

本发明从邻苯二甲酸酯类分子的侧链着手，合成了邻苯二甲酸酯类通用半抗原，暴露出邻苯二甲酸酯类共同的苯环和部分侧链基团，作为抗原决定簇，将半抗原与载体蛋白偶联最后形成人工抗原。 

发明内容

本发明的目的：针对现有邻苯二甲酸酯类抗原合成技术以及相应抗体的不足和缺陷，提供一种新型的邻苯二甲酸酯类半抗原以及人工抗原的合成方法，使得制备通用的、能用于多残留检测的邻苯二甲酸酯类单克隆抗体成为可能。 

本发明提供的邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原化合物，具有式I所示分子结构： 

（式I） 

本发明的技术方案：一种免疫检测用邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原的合成方法，合成路线为： 

以邻苯二甲酸与6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇发生酯化反应，再脱去芴甲氧羰酰基保护基，形成半抗原，半抗原通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化，或者通过三正丁胺与氯甲酸异丁酯活化，再与载体蛋白进行偶联，得到邻苯二甲酸酯塑化剂通用人工抗原，步骤如下： 

（1）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原的制备 

取0.5～1g邻苯二甲酸，1mL6-(芴甲氧羰酰基-氨基)-1-己醇，钛酸四丁酯10μL，二环己基碳二亚胺(DCC) 10mg，95℃反应12h，加入1M NaOH水溶液，中和反应液至pH 7.4～8，分层后弃水相，有机相再洗涤一次，减压35℃旋蒸，脱醇。在产物中加入10mL含20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，室温反应20min，脱去芴甲氧羰酰基保护基团，得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原（式1）。 

（2）邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原的制备 

取邻苯二甲酸酯类塑化剂通用半抗原加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，4℃下加入2.5%戊二醛溶液，半抗原:戊二醛的摩尔比为1:1.5，避光混匀搅拌反应1h，得活化的半抗原溶液； 

取牛血清白蛋白，半抗原与牛血清白蛋白的摩尔比为80:1，用0.1M pH9.6 碳酸盐缓冲液溶解,其中溶解后的牛血清白蛋白浓度大于3mg/mL，且碳酸盐缓冲液与N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的体积比例为5:1；在0℃下，将活化的半抗原溶液慢速滴加到牛血清白蛋白溶液中，0℃反应1h，室温下反应6h；用PBS缓冲液透析2天，期间更换PBS缓冲液4次，即得到邻苯二甲酸酯类塑化剂通用人工抗原。