[发明专利]牛源性肉制品分子鉴定试剂盒及应用

摘要

本发明属于肉制品分子检测技术领域，具体涉及一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法、试剂盒及应用。本发明步骤如下：(1)引物设计：根据普通牛TNFRSF10A基因序列设计特异引物，该引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。(2)建立PCR扩增反应方法，即以引物对普通牛基因组DNA进行扩增，得特异扩增片段。(3)对PCR扩增产物进行分析：采用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析，根据凝胶成像观察是否出现目的片段，判定是否含有普通牛基因组DNA成分。本发明特点是：简便，快速，特异性强，且成本较低，适合基层单位应用。

主权项

一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法，包括PCR反应，其特征在于下列步骤：1)采集牛源肉品试样，于‑20℃下保存备用；2)利用苯酚‑氯仿粗提法提取步骤1)所述牛源肉品的基因组DNA；3)设计的特异引物PCR扩增牛TNFRSF10A基因片段，其引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；4)扩增得到牛TNFRSF10A基因的核苷酸序列，该序列如序列表SEQ ID NO：1所示；5)利用反应试剂和反应程序进行PCR反应，对PCR反应产物进行电泳检测；6)在上述PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照；7)对PCR扩增产物进行检测和结果判定，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，判定为样品中检测出普通牛源性成分，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，判定为样品中未检测出牛TNFRSF10A基因即牛源性成分；其中：步骤5)所述的PCR反应的试剂如下：反应总体积：20.0μL；双蒸水：11.4μL；10×PCR缓冲液：2.0μL，室温，pH8.3‑9.0；延伸温度72℃；25mmol/L的氯化镁溶液：2.0μL，终浓度为2.5mmol/L；各2.5mmol/L的dNTPs混合溶液：1.6μL；10μmol/L的SEQ ID NO：2所示的引物0.4μL，终浓度为0.2μmol/L；10μmol/L的SEQ ID NO：3所示的引物0.4μL，终浓度为0.2μmol/L；5U/μL的Taq DNA聚合酶：0.2μL，终浓度为0.05U/μL；20ng/μL的受检样品DNA模板：2.0μL，终浓度为2.0ng/μL；步骤5)的PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循环；72℃延伸3min；步骤6)所述的阴性对照为非牛属动物水牛、绵羊或山羊，非牛科哺乳动物人、猪、小鼠的基因组DNA；步骤6)所述的阳性对照为牛科牛属普通牛、奶牛、肉牛、黄牛的基因组DNA。