[发明专利]牛源性肉制品分子鉴定试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法，专用试剂盒及应用。本发明的分子鉴定方法和试剂盒与PCR反应有关。 

背景技术

随着肉制品的普及度和覆盖度不断增加，为追求利益，市场上常常充斥着“挂羊头卖狗肉”的现象，肉制品来源的安全性成为消费者关心的焦点问题之一，因此对肉制品的来源进行鉴定并建立便捷的检测方法是解决这一问题的关键。目前国外已发表有关于饲料中动物源性的检测方法，其采用线粒体上的tRNALys及ATP酶ATPase subunits8and6亚基8和亚基6序列作为检测使用的目标序列。然而该目标序列从序列水平特异性并不优异，针对普通牛设计的引物检测结果中牛和羊的均有扩增产物，且在其他物种中有非特异性条带扩出。如何有效地判别出肉制品是否属于牛肉，并建立一种简单易行的检测方法具有紧迫性。 

为了寻找为牛所特异的检测序列，我们从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行牛基因组特异序列基因的筛选，经过非牛物种(水牛、山羊、绵羊、猪、人、鼠等)及不同的牛品种中的检测筛选在牛中特异的，在其他物种中不存在的基因片段作为检测分子。通过核酸数据库(EMBL、GenBank及Ensembl)查找普通牛的基因组序列，并通过BLAST分析及PCR扩增验证，确定牛特异基因。具体步骤为：a.基于Ensembl基因组数据库的BLAST筛选工作：首先采用BLASTP与多物种蛋白序列库(无亢余蛋白库，nr)进行比对筛选具有特异蛋白的基因；b.以筛选后基因的编码序列对非牛基因组序列进行BLASTN比对搜寻核酸特异序列；c.BLASTN牛基因组确定候选基因拷贝数情况；d.比对dbSNP数据库排除突变较多的基因。通过以上四步得到序列特异，拷贝数确定且序列保守的候选基因，并最终选定以牛肿瘤凋亡因子超家族受体成员10A，TNFRSF10A(tumor necrosis factor receptor superfamily 10a)作为检测使用的特异分子。 

在不同物种间，TNFRSF10A基因的序列同源性低，通过BLAST比对发现，牛TNFRSF10A第八外显子区段具有序列特异性(BLASTN/BLASTP比对已知数据库)。同时由于该序列为编码蛋白序列，其突变率低，物种内保守性高。通过序列比对确定该基因的拷贝数恒定，符合牛特异基因的选择要求。通过进一步的PCR验证最终选定以牛TNFRSF10A基因作为检测使用的基因。 

发明内容

本发明的目的在于建立一种有效、精准、可靠的牛源性肉制品分子鉴定方法，该方法与PCR反应有关。本发明还包括利用本发明的方法和试剂组合物组装的适用于检测牛源性肉制品的鉴定试剂盒及试剂盒的应用，本发明制备的试剂盒能快速鉴定肉制品是否含有普通牛源性成分，为市场监管提供一种快速方便的试剂盒。本发明的方法和试剂盒可以在肉品检测中作为标准检测方法使用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法，包含PCR反应，具体步骤如下所述： 

1)采集牛源肉品试样，于-20℃下保存备用； 

2)利用苯酚-氯仿粗提法提取步骤1)所述牛源肉品的基因组DNA； 

3)设计的特异引物PCR扩增牛TNFRSF10A基因片段，其引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3所示； 

4)扩增得到牛TNFRSF10A基因的核苷酸序列，该序列如序列表SEQ ID NO：1所示； 

5)利用反应试剂和反应程序进行PCR反应，对PCR反应产物进行电泳检测； 

6)在上述PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照； 

7)对PCR扩增产物进行检测和结果判定，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，判定为样品中检测出普通牛源性成分，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，判定为样品中未检测出牛TNFRSF10A基因即牛源性成分； 

其中： 

步骤5)所述的PCR反应的试剂如下： 

反应总体积：20.0μL； 

双蒸水：11.4μL； 

10×PCR缓冲液：2.0μL，室温，pH为8.3-9.0；延伸温度72℃； 

25mmol/L的氯化镁溶液：2.0μL，终浓度为2.5mmol/L； 

各2.5mmol/L的dNTPs混合溶液：1.6μL；