[发明专利]牛源性肉制品分子鉴定试剂盒及应用

权利要求书

1.一种牛肉源性肉制品的分子鉴定方法，包括PCR反应，其特征在于下列步骤：

1)采集牛源肉品试样，于-20℃下保存备用；

2)利用苯酚-氯仿粗提法提取步骤1)所述牛源肉品的基因组DNA；

3)设计的特异引物PCR扩增牛TNFRSF10A基因片段，其引物序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；

4)扩增得到牛TNFRSF10A基因的核苷酸序列，该序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

5)利用反应试剂和反应程序进行PCR反应，对PCR反应产物进行电泳检测；

6)在上述PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照；

7)对PCR扩增产物进行检测和结果判定，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，判定为样品中检测出普通牛源性成分，若普通牛TNFRSF10A基因特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，判定为样品中未检测出牛TNFRSF10A基因即牛源性成分；

其中：

步骤5)所述的PCR反应的试剂如下：

反应总体积：20.0μL；

双蒸水：11.4μL；

10×PCR缓冲液：2.0μL，室温，pH8.3-9.0；延伸温度72℃；

25mmol/L的氯化镁溶液：2.0μL，终浓度为2.5mmol/L；

各2.5mmol/L的dNTPs混合溶液：1.6μL；

10μmol/L的SEQ ID NO：2所示的引物0.4μL，终浓度为0.2μmol/L；

10μmol/L的SEQ ID NO：3所示的引物0.4μL，终浓度为0.2μmol/L；

5U/μL的Taq DNA聚合酶：0.2μL，终浓度为0.05U/μL；

20ng/μL的受检样品DNA模板：2.0μL，终浓度为2.0ng/μL；

步骤5)的PCR反应程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循环；

72℃延伸3min；

步骤6)所述的阴性对照为非牛属动物水牛、绵羊或山羊，非牛科哺乳动物人、猪、小鼠的基因组DNA；

步骤6)所述的阳性对照为牛科牛属普通牛、奶牛、肉牛、黄牛的基因组DNA。

2.适用于权利要求1所述方法的牛肉源性肉制品的PCR鉴定试剂盒，其特征包含下列试剂组合物：

dNTP；

25mmol/L的MgCl₂溶液；

10×PCR缓冲液；

各2.5mmol/L的Tag聚合酶；

阳性DNA模板；

阴性DNA模板；

SEQ ID NO：2所述的引物；

SEQ ID NO：3所述的引物，和

双蒸水；

上述阳性DNA模板为牛科牛属普通牛、奶牛、肉牛、黄牛的基因组DNA；

阴性DNA模板为非牛属动物水牛、绵羊或山羊，非牛科哺乳动物人、猪、小鼠的基因组DNA；

PCR反应程序如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸10s，30次循环；

72℃延伸3min。

3.如权利要求2所述的牛肉源性肉制品的PCR鉴定试剂盒，其特征还包含权利要求1所述方法的操作说明书。

4.权利要求2或3所述的试剂盒在检测肉源性制品中的应用。