[发明专利]以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法

摘要

本发明公开了一种以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，取5名健康人外周静脉血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g离心5分钟，取上层血浆500μl，将5人血浆混匀后，充分混匀，95℃5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液分装作为血浆ctDNA直接定量检测的标准品，分装后-20℃保存备用。本发明所产生的有益效果为：1.该技术不经过DNA提取步骤，可以去除DNA提取误差所导致的ctDNA测定误差；2.筛选了特定的18SrRNA编码基因的PCR引物序列组装ctDNA定量测定试剂盒，可以测定从60bp-350bp18S rRNA编码基因序列，结果的稳定性、重复性和高灵敏度方面有显著改善。

主权项

一种以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，其步骤如下：(1)取5名健康人外周静脉血各2ml，置于EDTA‑K2抗凝管中，2000g离心5分钟，取上层血浆500μl，将5人血浆混匀后，加入DNAse，终浓度10U/ml，37℃20分钟消化ctDNA，95℃5‑10分钟灭活DNAse，制备不含DNA的血浆基质；加入等体积的溶解在缓冲液中的外源性DNA，使终浓度为100ng/ml，充分混匀，95℃5‑10分钟，16000g离心10分钟，取上清液分装作为血浆ctDNA直接定量检测的标准品，分装后‑20℃保存备用；(2)取10ul标准品，加入90ul的0.5×缓冲液稀释10倍，再取10ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液再稀释10倍，依次稀释下去，制备出不同稀释倍数的标准品；(3)使用以下18S rRNA编码基因的PCR引物序列：18S‑F：CGTAGTTCCGACCATAAACGA；18S‑R1：GACAAATCGCTCCACCAACTA扩增子为62bp；18S‑R2：GCCCTTCCGTCAATTCCT扩增子为147bp；18S‑R3：GGCGGGTCATGGGAATAA扩增子为297bp；(4)分别取2ul不同稀释倍数的标准品血浆直接进行定量PCR扩增，PCR体系共20ul，包括快速复活热启动DNA聚合酶1ul、SuperGreen染料1ul、2x混合物10ul、终浓度为300nM的引物4ul以及H2O4ul；95℃5分钟；95℃5秒，60℃20秒，72℃20秒，重复40个循环；(5)绘制各引物对扩增的标准曲线，计算待测血浆中ctDNA含量；按以下公式计算DNA完整性指数DII：DII＝较大片段检测的ctDNA含量/较小片段检测的ctDNA含量。