[发明专利]以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及血液循环DNA测定技术领域，具体是一种以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法。

背景技术

血液循环DNA(Circulating DNA，ctDNA)，又称游离DNA或无细胞DNA(Cell-free DNA)，主要来源于细胞的凋亡和死亡。可作为肿瘤、自身免疫病及胎儿遗传学检测的依据。目前的检测方法均需要先从血清或血浆中提取DNA，然后扩增基因组中某个基因的方式，计算ctDNA的浓度或基因组拷贝数。由于个体间、不同病理状态间ctDNA含量及片段完整程度存在较大差异，即便不考虑操作者的因素，所用提取方法和试剂的不同就会造成提取效率存在巨大差别。在此基础上的ctDNA测定结果误差会更大。但直接用血浆或血清扩增，血清或血浆中含有的蛋白质等会严重干扰PCR，使标本间的扩增效率不一致。此外用于定量的测定对象也是影响检测重复性和敏感性的重要因素。文献报道多以b-actin等管家基因为检测对象，由于是单拷贝基因，检测灵敏度低。18S rRNA编码基因是一个极其稳定的保守基因序列，极少发生突变等，以其为检测对象，可显著提高检测稳定性。

发明内容

为了克服以上技术缺陷，本发明提供一种以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为，一种以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其步骤如下：

1、取5名健康人外周静脉血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g离心5分钟，取上层血浆500μl，将5人血浆混匀后，加入DNAse，终浓度10U/ml，37℃20分钟消化ctDNA，95℃5-10分钟灭活DNAse，制备不含DNA的血浆基质；加入等体积的溶解在缓冲液中的外源性DNA，使终浓度为100ng/ml，充分混匀，95℃5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液分装作为血浆ctDNA直接定量检测的标准品，分装后-20℃保存备用。

2、取10ul标准品，加入90ul的0.5×缓冲液稀释10倍，再取10ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液再稀释10倍，依次稀释下去，制备出不同稀释倍数的标准品。

3、使用以下18S rRNA编码基因的PCR引物序列：18S-F：CGTAGTTCCGACCATAAACGA；18S-R1：GACAAATCGCTCCACCAACTA(扩增子62bp)；18S-R2：GCCCTTCCGTCAATTCCT(扩增子147bp)；18S-R3：GGCGGGTCATGGGAATAA(扩增子297bp)。

4、分别取2ul不同稀释倍数的标准品血浆直接进行定量PCR扩增，PCR体系共20ul，包括快速复活热启动DNA聚合酶1ul、SuperGreen染料1ul、2x混合物10ul、终浓度为300nM的引物4ul以及H₂O4ul；95℃5分钟；95℃5秒，60℃20秒，72℃20秒，重复40个循环。

5、绘制各引物对扩增的标准曲线，计算待测血浆中ctDNA含量。按以下公式计算DNA完整性指数(DII)：DII＝较大片段检测的ctDNA含量/较小片段检测的ctDNA含量。

进一步，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁、三磷酸脱氧核苷。

进一步，所述三磷酸脱氧核苷包括终浓度均为0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。

进一步，所述不同稀释倍数的标准品的稀释倍数为1∶1、1∶10或者1∶100。

进一步，进行定量PCR扩增使用ROCHE LightCycler480定量PCR仪。

本发明所产生的有益效果为：1.该技术不经过DNA提取步骤，可以去除DNA提取误差所导致的ctDNA测定误差；2.筛选了特定的18S rRNA编码基因的PCR引物序列组装ctDNA定量测定试剂盒，可以测定从60bp-350bp18S rRNA编码基因序列，结果的稳定性、重复性和高灵敏度方面有显著改善；3.试剂价钱便宜，减少了使用DNA提取试剂盒的费用等，操作简便；4.可用于大规模肿瘤高危人群筛查、肿瘤的早期诊断及疗效预后的动态观察。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式进行详细说明

图1为以18S RNA为测定对象进行标准量ctDNA的PCR扩增后的荧光信号分析图

图2为血浆ctDNA含量与荧光强度的相关性曲线图

具体实施方式