[发明专利]以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法

权利要求书

1.一种以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)取5名健康人外周静脉血各2ml，置于EDTA-K2抗凝管中，2000g离心5分钟，取上层血浆500μl，将5人血浆混匀后，加入DNAse，终浓度10U/ml，37℃20分钟消化ctDNA，95℃5-10分钟灭活DNAse，制备不含DNA的血浆基质；加入等体积的溶解在缓冲液中的外源性DNA，使终浓度为100ng/ml，充分混匀，95℃5-10分钟，16000g离心10分钟，取上清液分装作为血浆ctDNA直接定量检测的标准品，分装后-20℃保存备用；

(2)取10ul标准品，加入90ul的0.5×缓冲液稀释10倍，再取10ul稀释后的血浆DNA，加入90ul的0.5×缓冲液再稀释10倍，依次稀释下去，制备出不同稀释倍数的标准品；

(3)使用以下18S rRNA编码基因的PCR引物序列：18S-F：CGTAGTTCCGACCATAAACGA；18S-R1：GACAAATCGCTCCACCAACTA扩增子为62bp；18S-R2：GCCCTTCCGTCAATTCCT扩增子为147bp；18S-R3：GGCGGGTCATGGGAATAA扩增子为297bp；

(4)分别取2ul不同稀释倍数的标准品血浆直接进行定量PCR扩增，PCR体系共20ul，包括快速复活热启动DNA聚合酶1ul、SuperGreen染料1ul、2x混合物10ul、终浓度为300nM的引物4ul以及H2O4ul；95℃5分钟；95℃5秒，60℃20秒，72℃20秒，重复40个循环；

(5)绘制各引物对扩增的标准曲线，计算待测血浆中ctDNA含量；按以下公式计算DNA完整性指数DII：DII＝较大片段检测的ctDNA含量/较小片段检测的ctDNA含量。

2.根据权利要求1所述的以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，所述2x混合物包括2x反应缓冲液、终浓度为3mM的氯化镁、三磷酸脱氧核苷。

3.根据权利要求1所述的以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，所述三磷酸脱氧核苷包括终浓度均为0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。

4.根据权利要求1所述的以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，所述不同稀释倍数的标准品的稀释倍数为1∶1、1∶10或者1∶100。

5.根据权利要求1所述的以18SrRNA基因为测定对象的ctDNA含量和完整性测定方法，其特征在于，进行定量PCR扩增使用ROCHE LightCycler480定量PCR仪。