[发明专利]一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法

摘要

一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法，属于分子生物学领域，为解决NSCLC患者EGFR基因T790M突变检测的临床应用瓶颈问题，而提供根据EGFR基因T790M突变体及野生型序列碱基的差异，通过设计合适的PCR引物在PCR扩增过程中导入特定的限制性内切酶切位点，建立了EGFR基因T790M突变酶切富集PCR法。本发明的主要优点在于：检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术；采用酶切富集的方法进行目标序列的PCR扩增进而用于检测，避免了产物中大量野生型序列对检测结果所造成的干扰；检测方法步骤简单，使用突变体基因片段特异性限制性内切酶酶切分析第二轮PCR产物达到准确检测突变体基因序列，大大提高检测准确率；采样方便，病人痛苦小，能够动态检测的优势。

主权项

一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法，其特征在于，操作步骤如下：①.采取患者的外周血标本，分离血浆/血清，提取游离核酸；②.应用游离核酸作为扩增模板使用引物ex20‑S1和ex20‑AS1进行第一轮PCR扩增；③.限制性内切酶1选择性酶切去除第一轮PCR产物中野生型基因片段，达到富集T790M突变体基因产物；④.应用第一轮PCR产物接受BstUI酶切后的酶切产物作为扩增模板使用引物ex20‑S2和ex20‑AS2进行第二轮PCR扩增:⑤.限制性内切酶2特异性酶切第二轮PCR产物中T790M突变体基因片段，达到特异性检测突变体基因；⑥.对酶切产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳－银染分析,鉴别EGFR基因T790M突变与否。