[发明专利]一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法

权利要求书

1.一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法，其特征在于，操作步骤如下：

①.采取患者的外周血标本，分离血浆/血清，提取游离核酸；

②.应用游离核酸作为扩增模板使用引物ex20-S1和ex20-AS1进行第一轮PCR扩增；

③.限制性内切酶1选择性酶切去除第一轮PCR产物中野生型基因片段，达到富集T790M突变体基因产物；

④.应用第一轮PCR产物接受BstUI酶切后的酶切产物作为扩增模板使用引物ex20-S2和ex20-AS2进行第二轮PCR扩增:

⑤.限制性内切酶2特异性酶切第二轮PCR产物中T790M突变体基因片段，达到特异性检测突变体基因；

⑥.对酶切产物行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳－银染分析,鉴别EGFR基因T790M突变与否。

2.如权利要求1所述的一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法，其特征在于，所述的PCR扩增引物ex20-S1和ex20-AS1序列如下：

引物名称：ex20-S1序列：5’-ACTGACGTGCCTCTCCCTCC-3’

引物名称：ex20-AS1序列：5’-CGAAGGGCATGAGCCGC-3’。

3.如权利要求1所述的一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法，其特征在于，所述的限制性内切酶1为限制性内切酶BstUI，酶切序列为CGCG基因序列。

4.如权利要求1所述的一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法，其特征在于，所述的PCR扩增引物ex20-S2和ex20-AS2序列如下：

引物名称：ex20-S2序列：5’-CCTCCAGGAAGCCTACGTGA-3’

引物名称：ex20-AS2序列：5’-CGAAGGGCATCAGCCGC-3’。

5.如权利要求1所述的一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法，其特征在于，所述的限制性内切酶2为限制性内切酶Hin1Ⅱ，酶切序列为CATG基因序列。