[发明专利]一种无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法

说明书

所属技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及的是无创检测表皮生长因子受体T790M突变的酶切富集PCR法。 

背景技术

非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）是一种常见的恶性肿瘤，在全球范围内发病率呈逐年升高趋势，已成为我国乃至全世界范围内肿瘤相关性疾病死亡的主要原因之一。NSCLC对常规放化疗均不敏感，以铂类和紫杉类为代表的第二、三代化疗药物虽然已被证明疗效较前有所提高，但相对于大部分晚期病人而言，总体生存获益并不大。近年来，随着对NSCLC细胞异常信号转导途径的不断阐明，以吉非替尼为代表的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制剂在改善晚期NSCLC患者疗效与生活质量中的作用已经得到国际多中心临床研究的充分肯定。然而，吉非替尼治疗的总体有效率仅为10%～30%，进一步的分子遗传学研究证实：吉非替尼对具有EGFR激酶区域特征性突变的NSCLC（外显子19缺失及外显子21L858R突变）患者疗效显著优于EGFR基因为野生型的NSCLC患者（存在EGFR基因外显子19缺失及外显子21L858R突变的患者接受吉非替尼治疗后客观缓解率提高到65%-94%）。遗憾的是，即便患者具有EGFR基因突变，随着治疗时间的延长最终均不可避免地产生吉非替尼获得性耐药而导致疾病进展；且吉非替尼价格 十分昂贵，患者服用一个月需要10000元左右，此外非必要的吉非替尼治疗还有可能产生严重的副作用如：致死性间质性肺炎。因此建立一种敏感特异、简便易行的临床诊断方法来准确地预测吉非替尼治疗NSCLC患者获得性耐药的发生成为临床上亟盼解决的重要问题。 

NSCLC对吉非替尼获得性耐药的分子机制复杂，目前得到普遍认同的是EGFR基因外显子20的T790M突变和c-MET原癌基因扩增，其中约50%以上的患者吉非替尼治疗获得性耐药与肿瘤细胞EGFR基因T790M突变有关；而c-MET基因扩增的鉴定需进行荧光原位杂交，技术要求高，操作繁琐，价格昂贵，对检测标本要求高。进一步的研究亦证明：NSCLC患者治疗前的EGFR基因T790M突变与患者接受吉非替尼治疗后的疗效呈显著负相关，因此通过检测EGFR基因T790M突变来准确地预测吉非替尼治疗NSCLC患者获得性耐药的发生是临床实践中切实可行的实验诊断方法。 

目前NSCLC患者EGFR基因T790M突变的检测标本多来自于支气管纤维镜、经皮肺细针穿刺活检标本或胸腔积液诊断标本，因而，EGFR基因T790M突变的检测仅局限于能够进行经支气管纤维镜、经皮肺细针穿刺活检或有胸腔积液的部分患者中，而且肺癌组织异质性明显，细针穿刺活检的少量标本能否代表整个肿瘤组织的遗传学变异尚有待进一步的研究确认。因此，迫切需要通过采样更为便捷、患者依从性好的方法来进行EGFR基因T790M突变诊断。 

研究已经发现：实体肿瘤在形成和发展过程中常常有少量癌细胞从原发肿瘤脱落进入血液循环，导致肿瘤患者外周血游离核酸含量显著高于健康人群，且外周血游离核酸与原发肿瘤的基因组DNA具有相同的遗传变异。但外周血中的游离核酸可能仅有非常少量的突变基因，而含有大量的野生型基因，其中混 杂的大量野生型基因会阻碍突变基因的检出，需要高度敏感特异的基因突变检测技术。目前已报道应用于EGFR基因T790M突变检测的方法有PCR扩增产物直接测序法、Taqman探针、PCR-SSCP、扩增阻滞突变检测系统等，上述方法各有利弊，临床未能开展EGFR突变检测的主要原因在于难以做到采样方法便捷，方法简便灵敏特异以及无需特殊的仪器设备等诸方面同时兼顾。因此，如能有效富集外周血中游离的突变体核酸，就能够解决NSCLC患者EGFR基因T790M突变检测的临床应用瓶颈问题。 

突变体酶切富集PCR法通过采纳野生型与突变体特异性限制性内切酶，选择性去除野生型序列片断，扩增突变序列，从而极大提高了检出血中靶目标肿瘤核酸的灵敏度，对靶基因突变的检测极限可达到0.1％[15]；依据该原理，本发明根据EGFR基因T790M突变体及野生型序列碱基的差异，通过设计合适的PCR引物在PCR扩增过程中导入特定的限制性内切酶切位点，建立了EGFR基因T790M突变酶切富集PCR法。 

发明内容

本发明的目的之一在于提供用于无创检测EGFR基因T790M突变的酶切富集PCR法，为实现上述目的的，申请人采用技术方案如下： 

1、采取患者的外周血标本，分离血浆/血清，提取游离核酸；