[发明专利]一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法

摘要

本发明涉及一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，该方法是先制备培养基，将热带假丝酵母菌接种于培养基上，采用放射源钴60γ-射线进行辐照诱变，并用诱变筛选培养基系统筛选获得高产长链二元酸的热带假丝酵母菌的突变菌株，从而提高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。

主权项

一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，其特征在于按下列步骤进行：制备培养基：a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0‑6.0g，氯化钠1.0‑1.5g，七水合硫酸镁0.5‑1.0g，蔗糖15.0‑25.0g，玉米浆1.0‑2.0g，酵母浸膏1.0‑2.0g，尿素2.5‑3.0g，维生素B10.1‑0.3g，正构烷烃C8‑C1840‑50ml，纯水1000ml；c、筛选培养基：筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0‑3.0g，磷酸氢二钾5.0‑6.0g，硫酸铵2.0‑3.0g，氯化钠1.0‑1.5g，酵母浸膏0.5‑1.0g，七水合硫酸镁0.5‑1.0g，琼脂15.0‑20.0g，正构烷烃nC8‑nC1820‑50ml，纯水1000ml，pH7.0；筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0‑3.0g，磷酸氢二钾5.0‑6.0g，氯化钠1.0‑1.5g，酵母浸膏0.5‑1.0g，硫酸铵2.0‑3.0g，七水合硫酸镁0.5‑1.0g，琼脂15.0‑20.0g，蔗糖15.0‑20.0g，纯水1000ml，pH7.0；筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0‑20.0g，磷酸二氢钠2.0‑3.0g，磷酸氢二钾5.0‑6.0g，氯化钠1.0‑1.5g，七水合硫酸镁0.5‑1.0g，酵母浸膏0.5‑1.0g，尿素1.5‑2.0g，琼脂15.0‑20.0g，正构烷烃nC8‑nC1820‑50ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0‑6.0g，氯化钠1.0‑1.5g，七水合硫酸镁0.5‑1.0g，蔗糖15.0‑25.0g，玉米浆1.0‑2.0g，酵母浸膏1.0‑2.0g，无水醋酸钠3.0‑4.0g，尿素2.0‑3.0g，维生素B10.1‑0.3g，硫酸铵2.0‑3.0g，丙烯酸0.001‑0.002g，正构 烷烃nC8‑nC18300‑400ml，纯水1000ml；热带假丝酵母菌的诱变：e、将热带假丝酵母菌菌株接入麦芽汁培养基斜面，在温度28‑34℃的培养箱中培养24‑48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴60γ‑射线进行辐照，辐照剂量为0.5‑0.7KGy，将辐照后的菌悬液进行梯度稀释，并涂麦芽汁平板，在温度28‑34℃的培养箱中与对照平板一起培养36‑72小时，选择经辐照后平板中成活率在10‑40%的热带假丝酵母菌的单菌落；f、将步骤e筛选出的平板中成活率在10‑40%的单菌落分别一一对应接种到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度28‑34℃的培养箱中培养36‑72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；g、再将步骤f筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度28‑34℃的培养箱中培养36‑72小时，选择R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；热带假丝酵母菌诱变菌株的验证h、将步骤g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤b种子培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤d发酵培养基中进行产酸培养。