[发明专利]一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法

权利要求书

1.一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，其特征在于按下列步骤进行：

制备培养基：

a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；

b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，尿素2.5-3.0g，维生素B₁0.1-0.3g，正构烷烃C₈-C₁₈40-50ml，纯水1000ml；

c、筛选培养基：

筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，硫酸铵2.0-3.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC₈-nC₁₈20-50ml，纯水1000ml，pH7.0；

筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，硫酸铵2.0-3.0g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，蔗糖15.0-20.0g，纯水1000ml，pH7.0；

筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0-20.0g，磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，酵母浸膏0.5-1.0g，尿素1.5-2.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC₈-nC₁₈20-50ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；

d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，无水醋酸钠3.0-4.0g，尿素2.0-3.0g，维生素B₁0.1-0.3g，硫酸铵2.0-3.0g，丙烯酸0.001-0.002g，正构烷烃nC₈-nC₁₈300-400ml，纯水1000ml；

热带假丝酵母菌的诱变：

e、将热带假丝酵母菌菌株接入麦芽汁培养基斜面，在温度28-34℃的培养箱中培养24-48小时，向斜面内加入15ml无菌水，用无菌接种环将菌体刮入无菌的含有玻璃珠的250ml三角瓶中，振荡30分钟充分打散菌体，分别吸取10ml菌悬液于50ml无菌三角瓶中，用钴60γ-射线进行辐照，辐照剂量为0.5-0.7KGy，将辐照后的菌悬液进行梯度稀释，并涂麦芽汁平板，在温度28-34℃的培养箱中与对照平板一起培养36-72小时，选择经辐照后平板中成活率在10-40%的热带假丝酵母菌的单菌落；

f、将步骤e筛选出的平板中成活率在10-40%的单菌落分别一一对应接种到含筛选培养基Ⅰ的平板和含筛选培养基Ⅱ的平板上，在温度28-34℃的培养箱中培养36-72小时，选择在筛选培养基Ⅰ平板上不生长而在筛选培养基Ⅱ平板上生长旺盛的热带假丝酵母菌的单菌落；

g、再将步骤f筛选出的单菌落接种于含筛选培养基Ⅲ的平板上，在温度28-34℃的培养箱中培养36-72小时，选择R值大的热带假丝酵母菌的诱变菌株，其中R为菌落产酸面积/菌落面积；

热带假丝酵母菌诱变菌株的验证

h、将步骤g得到的热带假丝酵母菌的诱变菌株按常规方法接种到步骤b种子培养基进行种子培养，再将培养好的种子接种到步骤d发酵培养基中进行产酸培养。