[发明专利]一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，该方法以提高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。

背景技术

长链二元酸是重要的精细化工中间体，可以合成香料、特种尼龙、聚酰胺热熔胶等一系列高附加值的特殊化学品，而长链二元酸不能从自然界中直接获得，化学合成又有许多难以克服的弊端，因此利用微生物技术制取长链二元酸引起了国内外的高度重视。

早在20世纪60年代国外就开始了利用微生物氧化正构烷烃制取长链二元酸的研究，但产酸量很低，难以实现工业化生产。日本矿业公司将选出的产酸能力最强的热带假丝酵母菌（No.1098菌株）经化学诱变和紫外线诱变，得到变异株M2030，该菌株发酵120小时，产酸130g/L。1977年日本矿业公司利用微生物氧化技术，以正构烷烃为原料成功的开发出制造长链二元酸技术，1982年建成年产100吨十三烷二元酸的工业化装置。

我国微生物发酵制取长链二元酸的研究工作开始于20世纪70年代，1999年在山东淄博建成利用微生物技术年产1000吨长链二元酸的生产装置。2005年后山东济宁、青岛、烟台等地陆续建成利用微生物技术年产3000-8000吨的长链二元酸生产装置。

生产长链二元酸的菌种的诱变筛选方法报道较多的有亚硝基胍诱变、紫外线照射诱变和离子束注入诱变，而采用放射源钴60γ-射线进行诱变的未见有报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，该方法是先制备培养基，将热带假丝酵母菌接种于培养基上，采用放射源钴60γ-射线进行诱变，并用诱变筛选培养基系统筛选获得高产长链二元酸的热带假丝酵母菌突变菌株，从而提高长链二元酸的产酸量和正构烷烃的转化率。

本发明所述的一种产长链二元酸的热带假丝酵母菌的诱变方法，按下列步骤进行：

制备培养基：

a、麦芽汁培养基:12Brix麦芽汁，2%琼脂；

b、种子培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，尿素2.5-3.0g，维生素B₁0.1-0.3g，正构烷烃nC₈-nC₁₈40-50ml，纯水1000ml；

c、筛选培养基：

筛选培养基Ⅰ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，硫酸铵2.0-3.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC₈-nC₁₈20-50ml，纯水1000ml，pH7.0；

筛选培养基Ⅱ：各组份为磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，酵母浸膏0.5-1.0g，硫酸铵2.0-3.0g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，琼脂15.0-20.0g，蔗糖15.0-20.0g，纯水1000ml，pH7.0；

筛选培养基Ⅲ：各组份为蔗糖15.0-20.0g，磷酸二氢钠2.0-3.0g，磷酸氢二钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，酵母浸膏0.5-1.0g，尿素1.5-2.0g，琼脂15.0-20.0g，正构烷烃nC₈-nC₁₈20-50ml，纯水1000ml，pH7.5，酚红指示剂1%；

d、发酵培养基：各组份为磷酸二氢钾5.0-6.0g，氯化钠1.0-1.5g，七水合硫酸镁0.5-1.0g，蔗糖15.0-25.0g，玉米浆1.0-2.0g，酵母浸膏1.0-2.0g，无水醋酸钠3.0-4.0g，尿素2.0-3.0g，维生素B₁0.1-0.3g，硫酸铵2.0-3.0g，丙烯酸0.001-0.002g，正构烷烃nC₈-nC₁₈300-400ml，纯水1000ml；

热带假丝酵母菌的诱变：