[发明专利]基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体

摘要

本发明涉及一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体，该方法包括蛋白磁珠交联步骤，将对照蛋白和靶蛋白分别与磁珠交联；第一轮筛选步骤，在初始DNA文库溶液中加入靶蛋白磁珠复合物进行第一轮筛选；重复筛选步骤，将前一轮筛选产物稀释2~10倍作为下一轮筛选的DNA文库溶液进行第二至N轮筛选；合成DNA步骤，对所述最终筛选产物进行克隆和测序，合成在数量上占优势且具有高亲和性的DNA序列得所述核酸适配体。本发明利用低浓度作为筛选条件以筛选出在极低浓度下都能与靶蛋白结合的高亲和力的核酸适配体，大大降低了PCR条件对筛选过程的影响，显著缩短了筛选的时间，减少了筛选轮数，提高了筛选的成功率。

主权项

一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：蛋白磁珠交联步骤，将对照蛋白和靶蛋白分别与磁珠交联，得到对照蛋白磁珠复合物和靶蛋白磁珠复合物；所述靶蛋白为内皮糖蛋白，所述对照蛋白为牛血清蛋白；第一轮筛选步骤，在初始DNA文库溶液中加入所述靶蛋白磁珠复合物进行正筛选并洗脱后，进行PCR扩增，分离为单链，得到第一轮筛选产物；重复筛选步骤，将前一轮筛选产物稀释2～10倍作为下一轮筛选的DNA文库溶液，先加入对照蛋白磁珠复合物进行负筛，再加入靶蛋白磁珠复合物进行正筛，并在洗脱后得到本轮筛选产物和上清；将每轮筛选产物及上清中的DNA进行PCR扩增，并比较每轮筛选产物和上清中的DNA量是否满足预设要求，是则得到最终筛选产物执行合成DNA步骤，否则利用未进行PCR扩增的本轮筛选产物执行重复筛选步骤进行下一轮筛选；合成DNA步骤，经3～4轮筛选对所述最终筛选产物进行克隆和测序，合成在数量上占优势的DNA序列，并经检测将能与所述靶蛋白特异性结合并具有高亲和力的DNA序列作为该蛋白的核酸适配体；所述高亲和力为DNA序列与内皮糖蛋白的平衡解离常数在微摩尔至纳摩尔之间。