[发明专利]基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体

权利要求书

1.一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

蛋白磁珠交联步骤，将对照蛋白和靶蛋白分别与磁珠交联，得到对照蛋白磁珠复合物和靶蛋白磁珠复合物；所述靶蛋白为内皮糖蛋白，所述对照蛋白为牛血清蛋白；

第一轮筛选步骤，在初始DNA文库溶液中加入所述靶蛋白磁珠复合物进行正筛选并洗脱后，进行PCR扩增，分离为单链，得到第一轮筛选产物；

重复筛选步骤，将前一轮筛选产物稀释2～10倍作为下一轮筛选的DNA文库溶液，先加入对照蛋白磁珠复合物进行负筛，再加入靶蛋白磁珠复合物进行正筛，并在洗脱后得到本轮筛选产物和上清；将每轮筛选产物及上清中的DNA进行PCR扩增，并比较每轮筛选产物和上清中的DNA量是否满足预设要求，是则得到最终筛选产物执行合成DNA步骤，否则利用未进行PCR扩增的本轮筛选产物执行重复筛选步骤进行下一轮筛选；

合成DNA步骤，经3～4轮筛选对所述最终筛选产物进行克隆和测序，合成在数量上占优势的DNA序列，并经检测将能与所述靶蛋白特异性结合并具有高亲和力的DNA序列作为该蛋白的核酸适配体；所述高亲和力为DNA序列与内皮糖蛋白的平衡解离常数在微摩尔至纳摩尔之间。

2.根据权利要求1所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述第一轮筛选步骤具体包括：

正筛步骤：取初始DNA文库溶液于95℃加热并置冰上迅速冷却，加入靶蛋白磁珠复合物，置于37℃摇床孵育1.5～2.5h，移去上清，用缓冲液洗涤三次；

文库洗脱步骤：加入无菌水后在95℃加热15～20分钟，冰上冷却，置磁力架3～5分钟，取上清；

PCR扩增步骤：以该上清为模板DNA文库溶液，并将该模板DNA文库溶液扩增16～20个循环后，分离单链并脱盐处理，得到第一轮筛选产物。

3.根据权利要求2所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述重复筛选步骤具体包括：

文库的预处理步骤：将前一轮筛选产物取稀释2～10倍后做为下一轮筛选的DNA文库溶液，在95℃加热并置冰上迅速冷却；

反筛步骤：取对照蛋白磁珠复合物3～10ug加入预处理得到的DNA文库溶液中，37℃摇床孵育30分钟～1.5小时，置磁力架上收集上清；

正筛步骤：将反筛得到的上清稀释，加入靶蛋白磁珠复合物3～10ug，37℃摇床孵育30分钟～1.5小时，移除上清，用缓冲液清洗三次，得DNA靶蛋白磁珠复合物；

文库洗脱步骤：在DNA靶蛋白磁珠复合物中加入无菌水，95摄氏度加热15～20分钟，冰上冷却，置磁力架3～5分钟，收集上清；重复用无菌水洗涤，收集每次的上清混合得到该轮筛选产物。

4.一种核酸适配体，其特征在于，采用根据权利要求1-3中任意一项所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法制备获得。