[发明专利]基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，更具体地说，涉及一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体。

背景技术

核酸适配体是指可与目标分子特异性结合的单链的寡核苷酸链分子（DNA或RNA），一般小于100mer。与抗体相比，核酸适配体与靶分子之间分子识别功能与抗体极为相似，但作用的靶分子范围更广，包括毒素免疫原性弱和不具有免疫原性的物质及能够识别单抗不能区分的相似物质，比抗体具有更高的特异性，亲和力更高。因其结构和性能的独特优越性，核酸适配体日益广泛地应用于生物医学基础研究、疾病诊治和药物研发。

通常，核酸适配体是通过指数级富集配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），筛选得到的。指数级富集配体系统进化技术的基本途径是将包含大容量的随机寡核苷酸序列的DNA文库溶液与靶分子共同孵育，并通过各种分离途径将结合复合物与未结合序列分离、洗脱、获得与靶分子结合的序列并对这些序列进行聚合酶链式反应扩增，经分离为单链后，生成次级文库，再用于下轮筛选，如此数轮反复后，挑选出富集的适配体，并进行测序即获得特异性识别靶分子的寡核苷酸序列，即核酸适配体。大容量的分子文库几乎涵盖了所有可能的立体构象，理论上可以针对任何靶分子筛选，得到其特异性识别的核酸适配体序列。

目前尚未建立针对任意靶标的标准筛选流程,亦不能保证凡筛选必有效。技术筛选过程复杂、筛选成功率受到众多影响因素制约。尤其是PCR条件对SELEX筛选过程具有明显的影响，一个差的PCR条件甚至导致筛选的完全失败。

为了得到高亲和性结合的核酸适体，在筛选的过程中，通常是通过逐步减少DNA文库与靶物质孵育的时间，增加洗涤次数和洗涤时间以及与增加对照物质的量及孵育时间来增强筛选压力。然而，DNA适配体与靶物质孵育时，DNA的浓度是影响两者之间的结合主要因素之一。但目前的SELEX技术，在每轮筛选后均采用PCR扩增，用较高浓度的DNA文库与靶物质孵育，未能利用调控浓度作为提高筛选压力的主要手段。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有核酸适配体筛选方法每轮筛选后均采用PCR扩增导致技术筛选过程复杂、筛选成功率低的缺陷，提供一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法及核酸适配体。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法，包括以下步骤：

蛋白磁珠交联步骤，将对照蛋白和靶蛋白分别与磁珠交联，得到对照蛋白磁珠复合物和靶蛋白磁珠复合物；

第一轮筛选步骤，在初始DNA文库溶液中加入所述靶蛋白磁珠复合物进行正筛选并洗脱后，进行PCR扩增，分离为单链，得到第一轮筛选产物；

重复筛选步骤，将前一轮筛选产物稀释2~10倍作为下一轮筛选的DNA文库溶液，先加入对照蛋白磁珠复合物进行负筛，再加入靶蛋白磁珠复合物进行正筛，并在洗脱后得到筛选产物和上清；将每轮筛选产物及上清中的DNA进行PCR扩增，并比较每轮筛选产物和上清中的DNA量是否满足预设要求，是则得到最终筛选产物执行合成DNA步骤，否则执行重复筛选步骤进行下一轮筛选；

合成DNA步骤，对所述最终筛选产物进行克隆和测序，合成在数量上占优势的DNA序列，并经检测将能与所述靶蛋白特异性结合并具有高亲和力的DNA序列做为该蛋白的核酸适配体。

在根据本发明所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，所述靶蛋白为内皮糖蛋白，所述对照蛋白为牛血清蛋白。

在根据本发明所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，所述第一轮筛选步骤具体包括：

正筛步骤：取初始DNA文库溶液于95℃加热并置冰上迅速冷却，加入靶蛋白磁珠复合物，置于37℃摇床孵育1.5~2.5h，移去上清，用缓冲液洗涤三次；

文库洗脱步骤：加入无菌水后在95摄氏度加热15~20分钟，冰上冷却，置磁力架3～5分钟，取上清；

PCR扩增步骤：以该上清为模板DNA文库溶液，并将该模板DNA文库溶液扩增16~20个循环后，分离单链并脱盐处理，得到第一轮筛选产物。

在根据本发明所述的基于DNA文库浓度递减的核酸适配体筛选方法中，所述重复筛选步骤具体包括：

文库的预处理步骤：将前一轮筛选产物取稀释2~10倍后做为下一轮筛选的DNA文库溶液，在95℃加热并置冰上迅速冷却；