[发明专利]基于PTO切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测

摘要

本发明涉及基于PTO切割以及延伸-依赖性切割（PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage：PCEC）试验的靶核酸序列的检测。本发明的特征在于，在随着靶核酸序列的存在与否而形成的延伸二聚物上，生成被核酸切割酶切割的切割位点。本发明检测延伸二聚物是否发生切割，由此决定靶核酸序列存在与否。

主权项

一种基于PCEC（PTO切割及延伸‑依赖性切割）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：步骤（a），将上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：（i）3’‑靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’‑标记部位，其包含与上述靶核酸序列非‑互补的核苷酸序列；上述3’‑靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’‑标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；步骤（b），在用于切割上述PTO的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的5’‑标记部位或者5’‑标记部位的一部分的片段；步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段与CTO进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的5’‑标记部位或者5’‑标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）模板化部位，其包含与上述PTO的5’‑标记部位以及3’‑靶向部位非‑互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的捕捉部位杂交；步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板‑依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；杂交于上述CTO的捕捉部位的上述片段，通过被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点；步骤（e），利用上述核酸切割酶来切割上述延伸二聚物，用于生成切割的片段；以及步骤（f），检测上述延伸二聚物是否发生切割，上述延伸二聚物发生切割表示上述靶核酸序列存在。