[发明专利]基于PTO切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测

权利要求书

1.一种基于PCEC（PTO切割及延伸-依赖性切割）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：

步骤（a），将上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；

步骤（b），在用于切割上述PTO的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段；

步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段与CTO进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）模板化部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的捕捉部位杂交；

步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；杂交于上述CTO的捕捉部位的上述片段，通过被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点；

步骤（e），利用上述核酸切割酶来切割上述延伸二聚物，用于生成切割的片段；以及

步骤（f），检测上述延伸二聚物是否发生切割，上述延伸二聚物发生切割表示上述靶核酸序列存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述核酸切割酶为限制酶，上述CTO的模板化部位包含被上述限制酶识别的序列，上述步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来生成上述限制酶的切割位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述核酸切割酶是核糖核酸酶，上述CTO的模板化部位包含RNA序列，通过形成上述步骤（d）的延伸二聚物来形成DNA-RNA混合二聚物，来生成上述核糖核酸酶的切割位点。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶，通过形成上述步骤（d）的延伸二聚物，在上述CTO上生成5’→3’外切核酸酶的切割位点。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，被上述核酸切割酶切割的切割位点是用于切割DNA二聚物、RNA二聚物或DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶的切割位点。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，上述核糖核酸酶是RNase H或ExoⅢ。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，上述5’→3’外切核酸酶是具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述核酸切割酶是热稳定性核酸切割酶。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述延伸二聚物具有至少1种标记，上述标记是与上述PTO或CTO相连接的标记或是来源于嵌入染料（intercalating dye）的标记，通过检测来自上述至少1种标记的信号来检测上述延伸二聚物是否发生切割。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，上述CTO具有单一标记，上述步骤（e）中，通过切割延伸二聚物来形成包含上述单一标记的切割片段，来自上述延伸二聚物被切割之前的单一标记的信号不同于来自上述延伸二聚物被切割之后的单一标记的信号，这种信号之差用于检测上述延伸二聚物是否发生切割。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，上述单一标记是荧光标记。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，被上述核酸切割酶切割的切割位点位于与上述CTO相连接的报道分子及猝灭分子之间，形成上述延伸二聚物之前，上述猝灭分子对来自上述报道分子的信号进行猝灭，通过切割上述延伸二聚物来使上述报道分子和上述猝灭分子相互分离，通过测定来自上述标记的信号来检测上述延伸二聚物是否发生切割。