[发明专利]基于PTO切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测

说明书

技术领域

本发明涉及基于PTO切割及延伸-依赖性切割（PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage：PCEC）试验的靶核酸序列的检测（Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage）。

背景技术

DNA杂交（hybridization）是分子生物学的基本的过程，受离子强度、碱基结构、核酸片段的长度、错配程度以及变性剂的存在的影响。基于DNA杂交的技术将成为决定特定核酸序列的非常有用的用具，将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。

但是，在仅依赖杂交的以往的方法以及过程中，发生因探针和非-靶序列之间的非-特异性杂交引起的假阳性结果的可能性高。因此，以往的方法以及过程存在改善可靠度的问题。

除探针杂交过程以外还提出了利用酶反应的几种接近法，例如，TaqMan^TM探针方法。

在TaqMan^TM探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记探针基于上游引物-依赖性DNA聚合酶的5’核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列存在的信号（美国专利第5,210,015号、第5,538,848号以及第6,326,145号）。TaqMan^TM探针方法提出用于信号产生的两种接近法：聚合-依赖性切割（polymerization-dependent cleavage）以及聚合-独立性切割（poly merization-independent cleavage）。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延伸必须在核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触之前发生。随着延伸反应的进行，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚合-独立切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此与靶核酸序列进行杂交，上游引物的3’-末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触来放出标记。并且，TaqMan^TM探针方法公开，通过在其5’-末端部位具有不与靶序列杂交的5’-尾巴区域的标记探针被切割来形成包含5’-尾巴区域的片段。

也有对具有对靶序列非-互补的5’-尾巴区域的探针被5’核酸酶切割，放出包含5’-尾巴区域的片段的几种方法的报告。

例如，美国专利第5,691,142号就公开了对基于DNA聚合酶的5’核酸酶活性来被切割的切割结构。公开中则例示有对包含对模板非-互补的5’部位以及对模板互补的3’部位的寡核苷酸与模板杂交，并且上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板进行杂交的切割结构。切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者具有减少的合成活性的变形DNA聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5’部位。之后，被放出的5’部位与具有发夹结构的寡核苷酸杂交，形成切割结构。由此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。

美国专利第7,381,532号则公开了具有3’-末端被阻断的上游寡核苷酸的切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者FEN核酸酶切割，来放出非-互补的5’皮瓣（flap）部位，被放出的5’皮瓣部位基于大小分析或者相互作用性双重标记来被检测的过程。美国专利第6,893,819号则公开了能够检测的被放出的皮瓣基于核酸合成依赖性的、皮瓣-媒介连续性扩增方法而生成的内容。在此方法中，从第一个切割结构放出的皮瓣，以核酸合成依赖性方式切割第二个切割结构来放出皮瓣，并检测被放出的皮瓣。

美国申请公开号第2008-0241838号中公开了利用在靶核酸序列具有非-互补的5’部位的探针的切割以及捕捉（capture）探针的杂交的靶检测方法。标记位于非-互补的5’部位。杂交于靶序列的标记探针被切割而放出片段，之后，片段与捕捉探针杂交而检测靶序列的存在。在此方法中，未切割的/完好无损的（uncleaved/intact）探针不与捕捉探针杂交是必须的。为此，需要长度短的捕捉探针在固相基质上实现固定化。但是，这种限制会降低固相基质上的杂交效率，并且使反应条件的最优化变得困难。

因此，对开发以更加便利、具有可靠性以及再现性的方式，不仅基于杂交，还基于5’核酸切割反应（5’nucleolytic reaction）等的酶反应，在液相以及固相中检测靶序列，更为优选地检测多个靶序列的新颖的接近法的要求正在抬头。并且，在本行业正需求一种不受限于标记（尤其，荧光标记）种类的数量的新颖的靶检测方法。